|
Popis vyšetření: ALKALICKÁ FOSFATÁZA
Zařezeno v kategoriích:
Synonyma:
fosfát-monoester fosfohydrolasa, EC 3.1.3.1; alkalická fosfomonoesterasa; fosfomonoesterasa; glycerofosfatasa; alkalická fenylfosfatasa; alkalická fosfohydrolasa; ortofosforečný monoester fosfohydrolasy.
Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu neexistuje, ale běžně se používá označení AP (Google 8 440 000), případně ALP (Google 537 000). Upozorňujeme, že označení AP se používá jak pro alkalickou, tak pro kyselou fosfatázu.
Preanalytická fáze:
Odebírat nalačno. Stabilita vzorku: 18 - 26 °C: 4 h (sérum), 2 dny (plazma – heparinát sodný), 2 - 8 °C: 3 dny, -20 °C: 4 týdny. Při rozmrazování se aktivita ALP zvyšuje. Při analýze lyofilizovaných sér po rekonstituci vodou nutno vyčkat > 90 min, jinak jsou výsledky vyšší ! Koncentrace ALP v erytrocytech je šestkrát vyšší než v séru a hemolýza proto výsledky měření falešně zvyšuje. Bilirubin tvoří diazoniovou sůl s α-naftylfosfátem a při fotometrii interferuje s p-nitrofenolem. Je-li vzorek při teplotě 56 °C 30 – 60 min, ztrácí ALP 80 až 90 % aktivity.
Poznámky k analytické metodě:
Normální hodnoty aktivity ALP závisí na použité metodě, věku (po 50. roku života hodnoty stoupají a to více u žen než u mužů), pohlaví, případně těhotenství (pokles hodnot ve 2. – 4. měsíci, ve 3. trimestru aktivita ALP vyšší 2 – 3-krát). U vegetariánů jsou normální hodnoty asi o polovinu vyšší. Pro aktivitu enzymu je zapotřebí hořečnatých a zinečnatých iontů, jakož i serin. Proto je aktivita ALP významně inhibována při použití EDTA, oxalátu nebo citranu jako antikoagulancií. Výsledky také snižují cystin, cystein, fluoridy a vápenaté ionty. Použití glycinu jako pufru vede k vytvoření komplexu s hořečnatými ionty. Je-li použito činidlo s vysokým obsahem fosfátů, také to vede k inhibici měřené reakce. Jsou-li použity v činidle soli manganu, dochází k aktivaci enzymu. Přidání sodných iontů ve vhodné koncentraci (90 – 120 mmol/l) zvyšuje aktivitu ALP přibližně o 16 %. Optimální pH reakce je mezi 9 – 10 a záleží na použitém pufru a substrátu. Nejvíce využívaným substrátem je p-nitrofenylfosfát, který je bezbarvý, zatímco reakční produkt p-nitrofenol intenzivně absorbuje při 403 nm. Transfosforylační pufry (2-metyl-2-amino-1-propanol – AMP, dietanolamin – DEA, tris(hydroxyaminometyl)-metan – Tris, N-methyl-d-glukamin – MEG) významně zvyšují rychlost reakce vzhledem ke klasickým pufrům (veronalový, uhličitanový, glycinový). Jako akcelerátor reakce se někdy používá také manitol. Pufr AMP aktivuje více střevní než jaterní a kostní izoenzym. Dalším používaným substrátem je α-naftylfosfát a detekce α-naftolu je při 340 nm (pH 10, uhličitanový pufr, přísada MgCl2). Byly popsány i fenolftaleinmonofosfát a tymolftaleinfosfát. Fluorimetrie používá 4-metylumbeliferylfosfát jako substrát a detekce 7-metylumbeliferonu se provádí při emisní záření 360 nm a excitačním záření 465 nm (uhličitanový pufr, pH 9,2). Kromě detekce fotometrem lze použít také HPLC postup s elektrochemickým detektorem (substrátem je fenylfosfát, detekovaný produkt je fenol). Metoda s p-nitrofenylfosfátem a AMP pufrem je kandidátkou na referenční metodu Národní komise pro standardy v klinických laboratořích a expertního panelu pro enzymy (NCCLS/EPE) s CV v sérii 3 – 6 %, ale mezilaboratorní CV je 17 – 28 %. Velmi důležitá je čistota transfosforylačních pufrů (zvyšují aktivitu ALP 2 až 6-krát). V DEA bývá významné množství monoetanolaminu (MEA). AMP může obsahovat inhibitory ALP jako jsou diaminy a 5-amino-3-aza-2,2,5-trimetylhexanol, které inaktivují enzym tím, že se vážou na zinečnaté ionty. Nečistoty se odstraňují zinečnatou solí kyseliny N-(2-hydroxyetyl)etylendiaminotrioctové. Pufr MEG (prof. Chromý) je jen průměrným akceptorem fosfátů, ale neobsahuje inhibitory jako aminoalkoholové pufry. Jeho výhodou ve srovnání s DEA je optimální pK = 9,63, téměř stejná reaktivita všech izoenzymů ALP a nízká viskozita. V p-nitrofenylfosfátu může být obsažen p-nitrofenol (vysoký činidlový blank), nebo vzniká spontánně (činidlový blank), případně jsou přítomné fosfáty (inhibice reakce). Je-li podíl séra v celkovém reakčním objemu 0,02 dochází při ředění k lepší disociaci agregátů ALP a tím k vyšší aktivitě enzymu. Linearita metod je obvykle v rozmezí 30 s až 15 min. Vzorky do aktivity 30 µkat/l lze zpracovat bez ředění. Doporučuje se start substrátem (v nutných případech vzorkem). Preinkubace do 5 min, jinak možnost inaktivace kostní ALP ! ALP v prostředí MEG vykazuje o 30 % vyšší aktivitu než v AMP. Certifikovaný referenční materiál viz Schiele F, Muller J, Colinet E, Siest G: Certification of an enzyme reference material for alkaline phosphatase (CRM 371) Clin Biochem 24:159-168, 1991.
Významné interference:
Některé přípravky aktivitu alkalické fosfatázy snižují: azatioprin, cyklosporin (po počátečním přechodném zvýšení aktivity ALP), klofibrát aj. Řada látek způsobuje zvýšení aktivity alkalické fosfatázy: aminoglykosidy, amiodaron, anopyrin, antikonvulsiva, aspirin (při dlouhodobém užívání), erytromycin, esterifikované estrogeny samotné nebo v kombibaci s androgeny (mohou také aktivitu snižovat !), etanol, fenobarbital, fenotiaziny, chlorpromazin, interleukin-2, izoniazid, levotyroxin, lithium, orální kontraceptiva, rhytmochin II, spasmoveralgin, verapamil aj. Všechny léky vyvolávající cholestázu způsobují zvýšení aktivity ALP, které může být až desetinásobné.
|