Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies, ASCA

Odebírá se venózní srážlivá krev. Stabilita v séru je při laboratorní teplotě 2 d, při 4 – 8 °C 5 – 14 d, při -20 °C 1 rok.

Na trhu jsou také ELISA soupravy pro IgM ASCA a nepřímou imunofluorescenci ASCA IgG, IgA a IgM. V našich laboratořích se běžně používají jen metody ELISA pro IgG ASCA a IgA ASCA.

ELISA IgG umožňuje in vitro kvantitativní vyšetření ASCA třídy IgG vůči Saccharomyces cerevisiae v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené purifikovaným kvasinkovým polysacharidem Saccharomyces cerevisiae. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 30 min při 20 – 28 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgA) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 15 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví stop činidlem a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG ASCA. Měření se provádí při 450/600-690 nm po 5 min. Rozsah měření 0,5 – 100 kU/l je na základě šestibodové kalibrace. Funkční citlivost 0,5 kU/l. Cut-off hodnota je 10 kU/l. Přesnost v sérii 4,3 – 8,8 %, mezi sériemi 3,8 – 7,5 %; linearita ředění 95 – 113 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 33,9 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

Jako značku lze při ELISA použít také ALP (konjugovanou s  protilátkou vůči lidskému IgG) a substrátem je pak p-nitrofenylfosfát. Stop činidlo je 1,2 M NaOH (inkubace 30 – 30 – 60 min). Absorbance p-nitrofenolu se odečítá při 405 nm a je přímo úměrná množství specifických protilátek. Při kvantitativním hodnocení se množství IgG ASCA ve vzorku uvádí na základě pětibodové kalibrace v dubletu v rozsahu 0 – 160 kU/l (lze použít i kvalitativní hodnocení a pak je cut-off kalibrátor č. 3 a pozitivní vzorek má > 0,9 cut-off, negativní < 0,8 cut-off). Preciznost v sérii je 5 %, mezi sériemi 8 %.

ELISA IgA umožňuje in vitro kvantitativní vyšetření ASCA třídy IgA vůči Saccharomyces cerevisiae v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené purifikovaným kvasinkovým polysacharidem Saccharomyces cerevisiae. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 30 min při 20 – 28 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgA protilátky (také IgG) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 15 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgA značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví stop činidlem a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgA ASCA. Měření se provádí při 450/600-690 nm po 5 min. Rozsah měření 0,5 – 100 kU/l je na základě šestibodové kalibrace. Funkční citlivost 0,5 kU/l. Cut-off hodnota je 10 kU/l. Přesnost v sérii 5,2 – 6,1 %, mezi sériemi 6,0 – 6,6 %; linearita ředění 95 – 113 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 33,9 mmol/l TAG a 684 µmol/l bilirubinu.

Jako značku lze při ELISA použít také ALP (konjugovanou s  protilátkou vůči lidskému IgA) a substrátem je pak p-nitrofenylfosfát. Stop činidlo je 1,2 M NaOH (inkubace 30 – 30 – 60 min). Absorbance p-nitrofenolu se odečítá při 405 nm a je přímo úměrná množství specifických protilátek. Při kvantitativním hodnocení se množství IgA ASCA ve vzorku uvádí na základě pětibodové kalibrace v dubletu v rozsahu 0 – 160 kU/l (lze použít i kvalitativní hodnocení a pak je cut-off kalibrátor č. 5 a pozitivní vzorek má > 1,4 cut-off, negativní < 1,2 cut-off). Preciznost v sérii je 3 %, mezi sériemi 3 – 6 %.  

V dostupné literatuře nejsou uvedené.