trijodthyronin free, FT₃

3,5,3´- trijódtyronin

Při analýze se upřednostňuje sérum, lze použít také plazmu (antikoagulans EDTA nebo heparin). Opakované zamrazení se nedoporučuje. Možná vazba na separátorové gely. Zakalené vzorky je nutné před analýzou odstředit.

Stabilita vzorku: T3 je dosti stabilní; separace séra může být v krajním případě odložena o 48 h; nicméně se doporučuje sérum zamrazit, pokud se neanalyzuje do 24 (48) h.

Stabilita v séru: 20 - 25 °C: 1 d, 4 - 8 °C: 14 dní, -20 °C: 3 měsíce. Biologický poločas 1,5 dne.

Hemolýza při analýze nevadí, ale je třeba se vyhnout silné hemolýze, kdy by mohlo jejím vlivem docházet k naředění vzorku.

Při RIA je třeba, aby nebyly pacientovi podávány v rámci terapie radionuklidy po dobu 14 dnů.        

Diskrepance mezi jednotlivými metodami pro T3 jsou větší než pro T4, což je dáno jednak tím, že se stanovuje nižší koncentrace, dále rozdílností v křížové reaktivitě u jednotlivých antisér, rozdílnými interferencemi bílkovin a rozdíly v citlivosti metod.

RIA je heterogenní postup, vyžadující oddělení volného a vázaného radioligandu. Značkou je ¹²⁵I. Nejvíce se využívá separace na pevné fázi, kdy je analog T3 vázán na stěny zkumavky. Monoklonální protilátka vůči T3 značená ¹²⁵I je se vzorkem inkubována (2 h, laboratorní teplota, třepání) a dochází ke kompetici mezi T3 ze vzorku a T3 ze stěn zkumavky o její vazebná místa. Pak se obsah zkumavky odsaje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci fT3. Rozsah metody je na základě pětibodové kalibrace 0,5 – 44 pmol/l. Analytická citlivost je 0,5 pmol/l, funkční citlivost 1,0 pmol/l. Preciznost v sérii dosáhla CV ≤ 6,4 %, mezi sériemi ≤ 5,5 %. Hemolytické, ikterické a lipemické vzorky ruší stanovení. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Heterogenní enzymová imunoanalýza ke stanovení T3 je v kompetitivním uspořádání a obvykle používá jako značku křenovou peroxidázu. Mikrotitrační destičky jsou potaženy protilátkou (polyklonální králičí) vůči T3. Přidá se T3 ze séra a konjugát T3 s POD a inkubuje se 60 min; jamky se vymyjí (3x) a přidá se substrát tetrametylbenzidin s H₂O₂. Barevná reakce se po 15 min (ve tmě) zastaví 0,15 M H₂SO₄ a absorbance se měří při 450 nm (do 30 min) vertikálním fotometrem (sekundární vlnová délka 600 – 650 nm). Celý postup se provádí za laboratorní teploty. Absorbance je nepřímo úměrná koncentraci fT3 ve vzorku. Detekční limit metody je 0,08 pmol/l. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je do 27,7 (61,6) pmol/l. Preciznost v sérii dosahuje CV ≤ 4,94 %, mezi sériemi ≤ 13,19 %. Silná hemolýza a lipémie ruší. Reagencie je třeba skladovat při 2 – 8 °C.

Heterogenní fluorescenční imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) je technika, kdy se celý imunochemický postup provádí na pevné fázi. Protilátka specifická vůči T3 je imobilizována na mikročásticích. Pak se přenese na matrici frity a přidá se T3 značený ALP, který obsadí zbylá volná místa na protilátce. Po inkubaci se provede promytí na fritě roztokem obsahujícím 4-metylumbeliferylfosfát (fluorogenní substrát). Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím roztokem vymyje volný T3 z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je fluorochrom. Intenzita fluorescence (excitace 485, emise 525 – 550 nm) je nepřímo úměrná koncentraci fT3 ve vzorku a je měřena fluorimetrem. Detekční limit metody je 1,7 pmol/l. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je do 46 pmol/l. Preciznost v sérii dosahuje CV 2,53 – 7,86 %, celkem 3,65 – 8,43 %. Hemoglobin, bilirubin a triacylglyceroly stanovení neruší. 

Fluorescence rozložená v čase (DELFIA) je heterogenní kompetitivní postup s použití chelátů europia jako značky. Excitační světlo je 340 nm, emisní pík europia 613 nm. Reakce probíhá v mikrotitračních destičkách. Do mikrotitračních destiček se pipetuje vzorek a monoklonální myší protilátka vůči europiu. Imunokomplex s monoklonální myší protilátkou vůči T3 je pak zachycen pomocí druhé protilátky vůči myšímu IgG, kterou jsou potaženy stěny jamek. Inkubace trvá 2 h za laboratorní teploty a třepání. Po promytí (4x) se přidá T3-Eu³⁺ a inkubuje 30 min při 4 °C. Po promytí (6x) se přidá zesilovací roztok, ionty europia jsou disociovány z vázané fáze a vytvoří intenzivně fluoreskující chelát, jehož fluorescence je nepřímo úměrná množství fT3 ve vzorku. Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,9 – 8,7 %, mezi sériemi 2,9 – 10,3 %. Analytická citlivost metody (±2 SD) je 1,5 pmol/l. Rozsah měření do 60 pmol/l. Křížová reaktivita: kyselina 3,3´,5-trijodthyrooctová 103 %, ostatní < 0,9 %.

Chemiluminiscenční analýza v dvoukrokovém uspořádání používá ovčí protilátku vůči T3 zakotvenou na paramagnetických částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek; po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá konjugát T3 značený akridiniumkarboxamidem a dále 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině fT3 a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 1,54 – 46 pmol/l. Preciznost v sérii je 1,4 – 4,2 %, celkově 2,3 – 5,0 %. Analytická senzitivita 1,54 pmol/l. Neruší hemoglobin (5 g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani triacylglyceroly (22,6 mmol/l).

Podobný princip zábleskové luminiscence s esterem akridinu jako markerem je v sekvenčním uspořádání. T3 ze vzorku se dělí s T3 analogem kovalentně navázaným na paramagnetické částice o omezený počet vazebných míst na monoklonální myší protilátce označené esterem akridinu. V první inkubaci (5 min, 37 °C) se váže T3 ze vzorku na protilátku. Ve druhé inkubaci (2,5 min, 37 °C) jsou zbylá volná místa protilátky obsazena T3 analogem s upevněnými paramagnetickými částicemi. Pak jsou paramagnetické částice odděleny v magnetickém poli a promyty, aby se odstranila volná protilátka s esterem akridinu a následně jsou částice suspendovány v roztoku peroxidu vodíku a chemiluminiscenční reakce je nastartována po nástřiku roztoku hydroxidu sodného do suspenze, čímž dochází k oxidaci esteru akridinu a emisi luminiscence. Intenzita luminiscence detekovaná luminometrem při 400 nm je nepřímo úměrná koncentraci T3 ve vzorku. Metoda s dvoubodovou rekalibrací je použitelná do 30,8 pmol/l. Analytická senzitivita (±2 SD) je 0,3 pmol/l. Preciznost v sérii CV 2,35 – 3,08 %, celkem 2,76 – 4,05 %. Křížová reaktivita: dijodtyronin 1,47 %, ostatní < 1,0 %. Stanovení neruší hemoglobin do 5 g/l, bilirubin do 342 µmol/l a triacylglyceroly do 11,3 mmol/l. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

SPALT (Solid phase antigen linked technique) je dvojstupňový sekvenční zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené konjugátem proteinu a T3 a monoklonální protilátka je navázána na derivát izoluminolu. Během první inkubace (10 min) se T3 ze vzorku naváže na protilátku. Při druhé inkubaci (10 min) obsadí zbylá volná místa T3 navázaný na magnetické částice. Promytím se odstraní nevázaný materiál, přidá se startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině fT3. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 0,46 – 46 pmol/l. Analytická citlivost 0,46 pmol/l, funkční citlivost 1,54 pmol/l. Preciznost v sérii 1,4 – 4,7 %, mezi sériemi 2,4 – 6,3 %. Stanovení neruší hemoglobin do 10 g/l, bilirubin do 342 µmol/l a triacylglyceroly do 33,9 mmol/l. Extrémně vysoké koncentrace protilátek vůči ovčímu imunoglobulinu mohou ovlivnit výsledky.

Jako značku lze použít také POD. Mikrotitrační destičky jsou potaženy T3. V prvním kroku se přidá standard nebo vzorek a ovčí protilátka značená křenovou peroxidázou. Proběhne kompetice (16 min) T3 ze vzorku a T3 ze stěn jamek o vazebná místa na ovčí protilátce. Po vymytí nenavázané frakce se přidá luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci fT3 ve vzorku. Rozsah metody je 0,77 – 35 pmol/l (ředění vzorků se nedoporučuje). Analytická citlivost je 0,18 pmol/l, funkční citlivost 0,77 pmol/l. Preciznost v sérii CV 1,1 – 4,0 %, celková 2,3 – 14,7 %. Zákal může ovlivnit výsledky testu. Interference mohou způsobit protilátky vůči tyroidním hormonům a heterofilní protilátky. Stanovení neruší hemoglobin do 5 g/l, bilirubin do 160 µmol/l a triacylglyceroly do 33,9 mmol/l.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující T3, monoklonální protilátka vůči testosteronu konjugovaná s ALP. Během inkubace se naváže fT3 na protilátku a pak se přidají paramagnetické částice potažené streptavidinem a biotinylovaný analog T3. Po inkubaci (imunokomplex s analogem T3 se přichytí na magnetické částice přes biotin-streptavidinovou kotvu) se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství fT3. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 1,4 – 46 pmol/l. Analytická citlivost 1,4 pmol/l. Preciznost v sérii 2,6 – 6,6 %, mezi sériemi 1,3 – 8,0 %. Hemoglobin (10 g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani triacylglyceroly (33,87 mmol/l) neruší. Křížová reaktivita salicylan sodný 13,39 %, ibuprofen 17,2 %, acetaminofen -5 %, furosemid 15,9 %, karbamazepin 12,7 %, kyselina olejová 11,4 %, D-biotin -7,3 %, ostatní ≤ 3,9 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sekvenčním uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované ovčí protilátky vůči T3. První reagencie (Chemibeads) je částice potažena dijodtyroninem a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a v následující inkubaci reagují Chemibeads a obsadí zbývající volná místa protilátky. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy obsahující obě částice (v případě, že se na protilátku vázala částice Chemibeads). Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je nepřímo úměrný hladině fT3 ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je na základě pětibodové kalibrace 0,8 – 46,2 pmol/l (nelze ředit). Analytická citlivost je 3 pmol/l, funkční citlivost 0,8 pmol/l. Preciznost v sérii 0,9 – 2,9 %, mezi sériemi 2,4 – 4,4 %. Interferují: diklofenak (38 %), furosemid (57 %), ibuprofen (34 %), kyselina linolová (60 %), kyselina mefanomová (49 %), kyselina olejová (42 %), fenylbutazon (15 %), fenytoin (17 %), kyselina salicylová (22 %), kyselina valproová (< 10 %). Hemoglobin (10 g/l), bilirubin (342 µmol/l) ani triacylglyceroly (11,3 mmol/l) neruší.

Elektrochemiluminiscence (ECLIA) následuje po imunoreakci na sekvenčním principu, kdy se vzorek (15 µl) inkubuje s monoklonální ovčí protilátkou, značenou ruthéniovým komplexem a v následné inkubaci se přidají biotinem značený T3 (obsadí zbývající volná místa) a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem (vytvoří se vazba biotin-streptavidin). Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se paramagnetické mikročástice zachytí magnetem na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se při 620 nm měří fotonásobičem. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci fT3 ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,4 – 50 pmol/l (ředit nelze). Analytická citlivost je 0,4 pmol/l, funkční citlivost 0,6 pmol/l. Preciznost v sérii CV 1,1 – 6,5 %, mezi sériemi 1,6 – 8,2 %. Hemoglobin (10 g/l), bilirubin (1128 µmol/l), RF (1200 kU/l) ani triacylglyceroly (22,6 mmol/l) neruší. Vzorky by neměly být odebrány pacientům podstupujícím léčbu s vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) po dobu nejméně 8 hodin od podání poslední dávky biotinu. Furosemid a Levothyroxin způsobují zvýšení naměřených hodnot i v terapeutických dávkách. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek proti test-specifickým protilátkám, streptavidinu nebo rutheniu.

Izotopová diluce s GC/MS byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda pro stanovení T3 v séru. Při tomto postupu se používá jako vnitřní standard ¹³C₉-T3. Před analýzou se provede odbílkování vzorek, extrakce a purifikace HPLC. Přeměna sérového T4 na T3 je kontrolována přídavkem ¹³C₆-T4. T3 a ¹³C₉-T3 byly přeměněny na N,O-diheptafluorbutyrylmetylesterové deriváty a monitorovány při m/z844 a 853. Při metodě neinterferují reverzní T3 a T4. Rozsah metody 0,92 – 11,2 pmol/l. Detekční limit byl 100 pg. Výtěžnost 98,5 – 101,5 %. Preciznost dosahuje CV 0,8 – 1,5 %.

Izotopová diluce s LC/MS/MS elektrosprejí byla vyvinuta a navržena jako referenční metoda pro stanovení T3 v séru. Při tomto postupu se používá jako vnitřní standard ¹³C₉-T3. Před analýzou se provede odbílkování vzorek, extrakce a purifikace HPLC. Přeměna sérového T4 na T3 je kontrolována přídavkem ¹³C₆-T4. Byly sledovány přechody m/z 652→606 pro T3 a 661→ 614 pro ¹³C₉-T3. Při metodě neinterferují reverzní T3 a T4. Rozsah metody 0,92 – 11,2 pmol/l. Detekční limit byl 18 pg. Výtěžnost 98,5 – 102,7 %. Preciznost dosahuje CV 0,9 – 1,2 %. 

Certifikovaný referenční materiál pro T3 nese označení IRMM-469 (Institute for Reference Materials and Measurements) obsahoval 3,3´,5-trijódtyronin o čistotě 97,1 % s rozšířenou nejistotou 0,7 %. 

Biologický poločas: 19 h.

Analytické požadavky (CLIA-88): Pro diagnostické účely je vychýlení ±5,7 %, preciznost CV 11,5 %; pro terapeutické účely vychýlení ±2,6 %, preciznost CV 5,2 %.

Toleranční limit EHK: 15 %.

Koncentrace T3 je v séru snížena: těhotenství 3. trimestr, věk > 65 let, amiodaron, atenolol,  fenytoin, heparin, kyselina valproová, metoprolol, propranolol, aj.

Koncentrace T3 je v séru zvýšena: cvičení, menopausa, nadmořská výška, volné mastné kyseliny, tepelný stres, alprenolol, amiodaron, D-tyroxin, perorální kontraceptiva, propranolol, aj.