retinol

Odebírá se venosní srážlivá krev (případně odběr do EDTA). Po odběru chráníme před světlem. Sérum je stabilní 2 d při 20 – 25 °C, 6 – 30 d při 4 – 8 °C, při -20 °C 12 měsíců.

UV fotometrie vyžaduje k analýze pouze 50 µl séra. Přidá se stejné množství 95 % etanolu a 150 µl petroléteru. Zkumavka se 45 s intenzívně třepe a pak 10 min centrifuguje při 3000 g. 100 µl petroléterové vrstvy se převede do mikrokyvety a absorbance β-karotenu se odečítá při 450 nm. Pak se petroléter odpaří při 40 °C (dle možnosti v proudu dusíku). Přidá se 10 µl chloroformu a 100 µl kyseliny trifluoroctové. Směs se intenzivně promíchá a vitamin A se měří při 620 nm proti blanku (kyselina trifluoroctová). Interference β-karotenu < 10 %. Preciznost v sérii byla 3,8 – 4,6 %, zpětný výtěžek 93,2 – 97,9 %.

Fluorimetrie se provádí ve vzorku naředěném 100x roztokem NaCl 0,1 mol/l. Není třeba extrakce. Fluorimetrie používá pro excitaci 335 nm a emise 460 nm. Preciznost v sérii je 1,58 – 1,79 %.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který používá zakotvenou specifickou protilátku vůči vitaminu A. Do jamek se přidává vzorek (ředěný 500x) nebo kalibrátor a konjugát vitaminu A s křenovou peroxidázou. Po inkubaci (1 h, 37 °C) a promytí 5x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂. Roztok se inkubuje 20 min (37 °C, ve tmě), pak se pipetuje kyselé stop činidlo. Absorbance při 450/540-570 nm se měří do 10 min a je nepřímo úměrná koncentraci vitaminu A ve vzorku. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,625 – 10 µg/l. Detekční limit je 0,312 µg/l. Preciznost v sérii je < 8 %, mezi sériemi < 10 %. Silně hemolytické vzorky nejsou vhodné pro analýzu.

HPLC na reverzní fázi používá jako vnitřní standard retinylacetát. Plazma je deproteinizovaná etanolem a pak extrahována do petroléteru. Organická vrstva je oddělena a odpařena. Odparek je rozpuštěn v etanolu a nastříknutý na kolonu C18 (60x4,6 mm) s velikostí zrna 3 µm při 35 °C. Jako mobilní fáze se používá metanol. Jako mobilní fáze lze také použít směs acetonitril-tetrahydrofuran-metanol-1% octan amonný 65:25:6:4. Při průtoku 0,9 ml/min trvá jeden cyklus 9 min. Retinol je detekován UV detektorem při 305 nm s precizností v sérii 2,1 – 6,3 %, mezi sériemi 3,1 %. Elektrochemický detektor používá potenciál +0,9 V, je citlivější než UV detektor a má uhlíkovou elektrodu s Ag/AgCl referenční elektrodou. Pro dělení se používá gradient voda-metanol-n-butanol.

LC-MS nevyžaduje derivatizaci a provádí se na C30 reverzní fázi s gradientovou elucí voda-metanol-metyl-terc.butyléter. Ke směsi se přidává octan amonný, aby se usnadnila tvorba iontových párů. Hmotnostní detektor s pozitivní elektrosprejí detekuje retinal m/z 285 a také fragment 269, odpovídající odštěpení vody.

Hodnoty snižuje: těhotenství (1. trimestr), abetalipoproteinémie, celiakie, cystická fibróza pankreatu, infekční hepatitida, hypotyreóza, obstrukční ikterus, malabsorpce, proteinová malnutrice, chronická nefritida, porušená resorpce tuků, retardace růstu, sprue, hořečnaté stavy, xeroftalmie, odběr do citrátu, UV záření, alkoholismus; léky: alopurinol, dietylstilbesterol, cholestyramin, kolestipol, neomycin.

Hodnoty zvyšuje: diabetes mellitus, hepatomegalie, hypercholesterolémie, idiopatická hyperkalcémie dětí, hyperlipidémie, selhání ledvin, hemolýza; léky: estrogeny, fenytoin, glukokortikoidy, karoteny, perorální kontraceptiva, probucol.