respiratory syncytial virus, respirační mnohojaderný virus

Průkaz se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans citrát). Stabilita protilátek při 2 – 8 °C 5 dnů, dlouhodobě při -20 až -80 °C. Opakované rozmrazování vzorku se nedoporučuje.

Všechny postupy jsou kvalitativní analýzy.

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (HeLa buňky infikované virem), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti beraním krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum, v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou); přidá se morčecí komplement alexin (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní) a inkubuje se 12 h při 4 °C; mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém a inkubuje 30 – 60 min (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze). Reakce se hodnotí v několika ředěních séra (1:8 až 1:64). Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr 1:8 je již pozitivní), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek.

Neutralizační test – sérum se smíchá s kulturou RSV a nechá se inkubovat. Obsahuje-li testované sérum protilátky proti tomuto viru, dojde k vazbě protilátek na receptory viru a jeho inaktivaci. Neobsahuje-li sérum protilátky, virus zůstane aktivní. Inkubovaným roztokem se poté naočkuje buněčná kultura. V pozitivním případě (sérum obsahuje protilátky proti viru) inaktivovaný RSV není schopen napadnout buňky a nedojde k vytvoření cytopatického efektu. Je-li sérum negativní, na buněčné kultuře je pod mikroskopem patrný cytopatický efekt. Metoda se obvykle provádí v několika ředěních séra (dvojkovou řadou, obvykle do 1:128). Vhodně naředěné sérum se pipetuje do jamek mikrotitračních destiček a inkubuje s RSV v Eagleově médiu (obsahuje aminokyseliny, soli, glukózu a vitaminy) 7 dní při 37 °C. Přidá se suspenze morčecích erytrocytů ve fosfátovém pufru a nechá se adsorbovat 15 min při 4 °C. Pak se promyje fosfátovým pufrem a v místech replikace viru je viditelná hemadsorpce. Při odečítání hemadsorpce může být dosaženo zvýšení citlivosti přidáním směsi 4 % roztoku o-tolidinu v kyselině octové a 10 % H₂O₂ ve fosfátovém pufru. Po 1 – 2 min za laboratorní teploty se vyvine tmavě zelené zbarvení v jamkách obsahujících erytrocyty. Protože o-tolidin je kancerogenní, lze jej nahradit jinými redox indikátory, např. guajakolem nebo tetrametylbenzidinem. Nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek.

ELISA IgG v mikrotitračních destičkách, které mají zakotvený purifikovaný antigen RSV. V prvním kroku se váží veškeré specifické protilátky (IgG+IgM+IgA) na RSV v jamkách (inkubace 30 min za laboratorní teploty). Po vypláchnutí (4x) se přidá konjugát lidské protilátky vůči IgG značený peroxidázou. Po inkubaci 30 min za laboratorní teploty opětném vypláchnutí (4x) se přidá peroxid vodíku a tetrametylbenzidin. Reakce v temnu se zastaví po 10 min okyselením (0,2 M H₂SO₄), žluté zbarvení se detekuje do 10 min vertikální fotometrií při 450/620-630 nm. Pro kvalitativní hodnocení se výsledky < 0,9 cut-off kalibrátoru považují za negativní, výsledky > 1,1 cut-off kalibrátoru jsou pozitivní, mezitím je šedá zóna. Semikvantitativní hodnocení (kU/l) se provádí tak, že se cut-off kalibrátoru přiřadí koncentrace 50 kU/l. Preciznost CV v sérii 5,4 %, mezi sériemi 9,5 – 11,7 %. Senzitivita je 86,3 % a specifita 100 % pro anti-RSV IgG. Vzorky hemolytické, lipemické nebo ikterické mohou způsobit chybné výsledky. Jiný postup připouští 10 g/l hemoglobinu, 342 µmol/l bilirubinu a 5,6 mmol/l triacylglycerolů v séru.

ELISA IgM v mikrotitračních destičkách, které mají zakotvený purifikovaný antigen RSV. V prvním kroku se váží veškeré specifické protilátky (IgG+IgM+IgA) na RSV v jamkách (inkubace 30 min za laboratorní teploty). Po vypláchnutí (4x) se přidá konjugát ovčí protilátky vůči IgM značený peroxidázou. Po inkubaci 30 min za laboratorní teploty opětném vypláchnutí (4x) se přidá peroxid vodíku a tetrametylbenzidin. Reakce v temnu se zastaví po 10 min okyselením (0,2 M H₂SO₄), žluté zbarvení se detekuje do 10 min vertikální fotometrií při 450/620-630 nm. Pro kvalitativní hodnocení se výsledky < 0,9 cut-off kalibrátoru považují za negativní, výsledky > 1,1 cut-off kalibrátoru jsou pozitivní, mezitím je šedá zóna. Semikvantitativní hodnocení (kU/l) se provádí tak, že se cut-off kalibrátoru přiřadí koncentrace 50 kU/l. Preciznost CV v sérii 2,9 – 3,2 %, mezi sériemi 6,5 – 6,8 %. Senzitivita je 100 % a specifita 86,6 % pro anti-RSV IgM. Vzorky hemolytické, lipemické nebo ikterické mohou způsobit chybné výsledky. Jiný postup připouští 10 g/l hemoglobinu, 342 µmol/l bilirubinu a 5,6 mmol/l triacylglycerolů v séru.

ELISA IgA v mikrotitračních destičkách, které mají zakotvený purifikovaný antigen RSV. V prvním kroku se váží veškeré specifické protilátky (IgG+IgM+IgA) na RSV v jamkách (inkubace 30 min za laboratorní teploty). Po vypláchnutí (4x) se přidá konjugát ovčí protilátky vůči IgA značený peroxidázou. Po inkubaci 30 min za laboratorní teploty opětném vypláchnutí (4x) se přidá peroxid vodíku a tetrametylbenzidin. Reakce v temnu se zastaví po 10 min okyselením (0,2 M H₂SO₄), žluté zbarvení se detekuje do 10 min vertikální fotometrií při 450/620-630 nm. Pro kvalitativní hodnocení se výsledky < 0,9 cut-off kalibrátoru považují za negativní, výsledky > 1,1 cut-off kalibrátoru jsou pozitivní, mezitím je šedá zóna. Preciznost CV v sérii 4,4 – 7,0 %, mezi sériemi 10,3 – 10,8 %. Senzitivita je 100 % a specifita 100 % pro anti-RSV IgA. Vzorky hemolytické, lipemické nebo ikterické mohou způsobit chybné výsledky. Jiný postup připouští 10 g/l hemoglobinu, 342 µmol/l bilirubinu a 5,6 mmol/l triacylglycerolů v séru.

Může se vyskytnout zkřížená reaktivita mezi protilátkami proti RSV a dalšími chorobami dýchacího ústrojí.