Legionella pneumophila antibodies, Legionnaires  disease antibodies

Odebírá se venózní srážlivá krev; je třeba vyloučit chylozitu, ikterus a hemolýzu. Opakovaný odběr se provádí v období do 30 dnů. Sérum je stabilní minimálně 2 d při laboratorní teplotě, 14 d při 4 – 8 °C, 1 rok při -20 °C. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.

Je důležité vyšetřit jak IgG tak IgM protilátky.

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (L. pneumophila), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti beraním krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum, v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou); přidá se morčecí komplement alexin (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní); mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze. Reakce se hodnotí v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek. Při reakci se projevuje vyšší afinita IgM protilátek.

Latexová aglutinace používá antigeny L. pneumophila rozrušené ultrazvukem, které jsou ukotvené na latexových částicích. Senzitivita testu je 97,6 %, specifita 98,3 %. Latexové činidlo se smíchá se sérem na černém skle a reakce se hodnotí po 1 min; zřetelná aglutinace znamená pozitivní výsledek. Séra se ředí dvojkovou řadou pufrem obsahujícím glycin a hovězí albumin.

ELISA je určena pro důkaz IgG+IgM protilátek. V jamkách mikrotitrační destičky je zakotvena směs antigenů L. pneumophila séroskupin 1 – 6. Po přidání séra se naváží specifické protilátky (inkubace 20 – 30 min). Přebytek protilátky se vymyje (3 – 5x). Pak se přidá kozí protilátka vůči lidskému IgG/IgM konjugovaná s křenovou peroxidázou (inkubace 20 – 30 min). Přebytek konjugátu se odstraní pomytím (3 – 5x) a přidá se tetrametylbenzidin. Reakce je po 15 min zastavena 0,5 M H₂SO₄ a žluté zbarvení se měří do 60 min při 450/600-650 nm. Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Výsledky se hodnotí vzhledem k absorbanci kalibrátoru. Negativní ≤ 0,9; neurčité 0,91 – 1,09 a pozitivní ≥ 1,10. Senzitivita testu je 90 %, specifita 98,5 %.

Nepřímá imunofluorescence Proužek s 12 jamkami byl naplněn suspenzí tepelně a éterem usmrcených baktérií L. pneumophila (Philadelphia 1). Proužek byl sušen suchým vzduchem 30 min za laboratorní teploty, přidán aceton a po 15 min opět sušen suchým vzduchem 15 min. Při uskladnění -20 °C je antigen použitelný 5 dní. Sérum ředěné 1:16 v 3 % roztoku žloutkového vaku bylo naředěno stejným dílem fosfátového pufru (pH 7,6). Konjugátem pro nepřímou imunofluorescenci byl fluorescein izotiokyanát s králičí protilátkou vůči lidskému IgG. Ředění séra se provádí dvojkovou řadou až do 1:512 a jako titr se uvádí nejvyšší ředění, vykazující s antigenem fluorescenci 1+.

Falešná negativita: sérokonverze může být opožděná.

Falešná pozitivita může být způsobena řadou bakterií jako Pseudomonas species, Burkholderia species a jinými gram-negativními bakteriemi.