Proinsulin

Stanovení se provádí nalačno v plazmě (antikoagulans heparin) nebo séru. Materiál je třeba ihned zpracovat, odstřeďovat v chlazené centrifuze. Při zmrazení na -20 °C je stabilita proinzulinu 12 týdnů, pro dlouhodobé uchování se doporučuje -70 °C.

Přesné měření proinzulinu je poměrně obtížné, protože se rozpadá na inzulin a C-peptid, které jsou v krvi také přítomné. Teprve syntetická příprava proinzulinu a následně monoklonální protilátky vůči němu umožnila vyvinout poměrně spolehlivé metody. RIA postup byl velmi pomalý (navázání stanovovaného proinzulinu na kozí polyklonální protilátku 48 h, následná kompetitivní reakce s ¹²⁵I-proinzulinem 22 h) i když interference s inzulinem a C-peptidem byla < 0,1 %.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou monoklonální protilátkou vůči C-peptidové části proinzulinu. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje (třepání) 30 min. Po trojnásobném promytí se pipetuje monoklonální protilátka vůči inzulinové části proinzulinu s navázanou křenovou peroxidázou.  Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá chromogen dimetylbenzidin a reakce probíhající ve tmě 15 min (třepání) je zastavena stop činidlem (4,9 % H₂SO₄). Měření při 450 nm nutno provést do 20 min (možno i bichromaticky proti 405 nebo 630 nm). Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani heterofilní protilátky. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0,6 – 100 pmol/l. Preciznost v sérii je 2,9 – 3,2 %, mezi sériemi 1,4 – 2,5 %. Detekční limit je 0,6 pmol/l (některé metody mají až 0,25 pmol/l). Linearita ředění 90 – 114 %, zpětný výtěžek 98,4 – 105,2 %. Efekt nadbytku antigenu u podobné metody nebyl pozorován do 80000 pmol/l.

HPLC metoda rozliší inzulin, proinzulin a jeho štěpy, ale je pracná a vyžaduje extrakční kroky. Lze také použít LC-MS na reverzní fázi s gradientem 0,08 % trifluoroctové kyseliny v acetonitrilu proti 0,1 % trifluoroctové kyselině ve vodě.

Výsledky snižuje: pozdní separace séra, hemolýza (vliv erytrocytárních peptidáz).

Výsledky snižují: glukokortikoidy, růstový hormon, obezita, aplikace glukózy.