kortisol, hydrokortizon, hydrokortison;

cortisol, 11-epicortisol, epicortisol, hydrocortisone, 11-α-hydrocortisone, 9-β,10-α,11-α-hydrocortisone,

kortisol acetonid; (11β)-11-hydroxy-17,21-[(1-methylethyliden)bis(oxy)]-pregn-4-en-3,20-dion

Cortifair, Cortril, Cortef, Hydrocortone

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans heparin, EDTA, oxalát – nelze použít citrát!). Odběr krve je nutný vždy ve stejnou dobu vzhledem k denním cyklům (nejlépe před nebo v 8 h nebo mezi 16 – 19 h). Před odběrem vleže se zavede katétr alespoň 15 min, je třeba vyloučit tělesnou zátěž a stres. Při sledování denního profilu se odebírá krev kanylou nejdříve 2. den hospitalizace v 8, 12, 18 a 24 h (nebo alespoň v 8 a 22 h). Denní amplituda 50 – 250 %. Noční profil kanylou je v 15 minutových intervalech bez probuzení pacienta. Stabilita v séru 15 – 25 °C 1 – 7 d, při 4 °C 7 – 14 d, při -20 °C 3 týdny až 3 měsíce i déle. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.

Porter-Silberova fotometrická detekce reakce kortizolu s fenylhydrazinem v alkoholickém roztoku kyseliny sírové a fluorimetrické sledování fluorescence kortizolu, vyvolané kyselinou sírovou jsou historické metody. V současné době se používá pouze imunochemie a chromatografie. K dispozici je také kapilární elektroforéza.

RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 1 h za stálého třepání při laboratorní teplotě s ¹²⁵I-kortizolem ve zkumavkách potažených monoklonální myší protilátkou vůči kortizolu. Po inkubaci se obsah zkumavek dekantuje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci kortizolu ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace 5 – 2000 nmol/l (při vyšších koncentracích ředit nulovým kalibrátorem). Analytická citlivost je 5 nmol/l. Preciznost v sérii je 5,8 %, mezi sériemi 9,2 %; linearita ředění 86 – 115 %, zpětný výtěžek 95 – 113 %. Nepoužívat hemolytické, ikterické a lipemické vzorky. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. U pacientů, léčených vysokými dávkami těchto léků může docházet ke zvýšení hladin kortizolu v moči a séru v důsledku vlivu samotných léčiv nebo jejich metabolitů.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který používá zakotvenou králičí protilátku vůči kortizolu a do jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor a kortizol značený POD. Po inkubaci (45 min, třepání) a promytí 3x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂ v dimetylsulfoxidovém pufru. Roztok se inkubuje 15 – 20 min (třepání), pak se pipetuje stop činidlo (1 M H₂SO₄). Absorbance při 450 nm se měří do 20 min a je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu ve vzorku (při vysokých absorbancích lze použít 405 nebo 415 nm).  Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 11 – 1656 nmol/l (při vyšších koncentracích se ředí 8x nulovým kalibrátorem). Preciznost v sérii je 2,9 – 9,4 %, mezi sériemi 3,8 – 8,1 %; linearita ředění 83,7 – 116,4 %, zpětný výtěžek 90,4 – 123,2 %. Silná hemolýza, lipémie a ikterus ruší stanovení. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

FPIA Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze. Vzorek se pipetuje spolu s fosfátovým pufrem, myší monoklonální a kozí polyklonální protilátkou vůči kortizolu. Po změření blanku se přidá kortizol značený fluoresceinem. Po inkubaci se měří fluorescence (excitace 490 nm, emise 517 nm), která je nepřímo úměrná množství kortizolu. Rozsah kalibrace na základě šesti kalibrátorů 30,4 – 1656 nmol/l (vyšší koncentrace kortizolu lze ředit manuálně 2x). Analytická citlivost 30,4 nmol/l. Preciznost v sérii je 5,3 – 13,9 %, celkově 6,1 – 15,0 %. Linearita ředění je 94,9 – 110,5 %, zpětný výtěžek 92,6 – 100,4 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (171 µmol/l) a triacylglycerolů (17 mmol/l) neruší. Křížová reaktivita: prednisolon 32,2 %, 11-deoxykortizol 13,6 %, kortikosteron 8,0 %, dexametazon 2,0 %, ostatní < 1,5 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission) nebo HTFR (homogeneous time-resolved fluorescence), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (D₂-kortizol na sběrném proteinu) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá 2 h při 37 °C mezi kortizolem ze vzorku a D₂-kortizolem, který je připojený na sběrný protein o vazebná místa na monoklonální protilátce vůči kortizolu značené Eu³⁺. Měřený signál je nepřímo úměrný koncentraci kortizolu ve vzorku. V případě HTFR předchází imunoreakci s fluorescenční detekcí ještě iniciační krok, kdy vzorek (nejen sérum, ale i třeba celé buňky či buněčný supernatant) reaguje s jaterními mikrosomy v přítomnosti NADPH a inhibitorů (karbenoxolon, enoxolon) v pufru TRIS 2 h při 37 °C. Rozsah metody je na základě 6 kalibrátorů 0,2 – 300 nmol/l.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Mikrotitrační destičky jsou potaženy streptavidinem. Po pipetování vzorku se přidá biotinylovaná protilátka vůči kortizolu a protilátka vůči kortizolu značená Eu³⁺. Po inkubaci (2 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí 6x, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 15 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm) je přímo úměrná koncentraci kortizolu ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě osmibodové kalibrace je rozsah metody 4,8 – 1600 nmol/l kortizolu. Detekční limit 4,84 nmol/l. Preciznost v sérii 6,4 – 8,7 %, mezi sériemi 5,8 – 10,8 %. V literatuře je popsána i kompetitivní varianta DELFIA, kdy do reakce vstupuje kortizol- Eu³⁺, pak je fluorescence nepřímo úměrná koncentraci kortizolu ve vzorku. Hemoglobin 5 g/l a bilirubin 513 µmol/l neinterferují, ale triacylglyceroly 5,65 mmol/l při stanovení ruší.

Chemiluminiscenční analýza v dvoukrokovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči kortizolu, zakotvené na paramagnetických částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek. Po inkubaci se přidá konjugát kortizolu s akridiniumkarboxamidem. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině kortizolu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 11 – 1650 nmol/l (Vzorky s hodnotami kortizolu > 1650 nmol/l lze automaticky 2x nebo manuálně ředit 4x; po ředění musí být hodnota > 82,8 nmol/l). Preciznost v sérii je 2,1 – 6,1 %, celkově 2,5 – 7,7 %. Analytická citlivost 11 nmol/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (22,6 mmol/l) neruší. Křížová reaktivita: fludrokortizon 36,6 %, prednisolon 12,3 %, kortizon 2,7 %, ostatní < 2 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Kortizol značený esterem akridinu se inkubuje spolu se vzorkem 2,5 min a paramagnetickými latexovými částicemi s kovalentně připojenou monoklonální myší protilátkou vůči králičímu IgG, na kterou je navázaná králičí polyklonální protilátka vůči kortizolu. Směs se inkubuje 5 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Rozsah kalibrace na základě dvou standardů je 5,5 – 2069 nmol/l. Luminiscence záblesku je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu. Vzorky s koncentrací kortizolu > 2069 nmol/l se ředí automaticky 2x nebo manuálně podle potřeby. Analytická citlivost je 5,5 nmol/l. Preciznost v sérii 2,9 – 3,7 %, mezi sériemi 1,9 – 5,5 %. Linearita ředění je 86,2 – 114 %, zpětný výtěžek 88,2 – 113 %. Hemoglobin (5 g/l), triacylglyceroly (13,2 mmol/l) a bilirubin (342 µmol/l) neruší. Křížová reaktivita: prednisolon 109 %, prednison 34 %, kortizon 31,1 %, 6-metylprednisolon 26,2 %, 11-deoxykortizol 23,3 %, 21-deoxykortizol 8,1 %, 6-β-hydroxykortizol 6,8 %, allo-tetrahydrokortizol 6,5 %, kortikosteron 5,3 %, ostatní < 2 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

CLIA (SPALT = Solid Phase Antigen Linked Technique) je jednostupňový kompetitivní zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené konjugátem proteinu a kortizolu. Monoklonální myší protilátka vůči kortizolu je značená izoluminolem. Kortizol ze vzorku soutěží o její vazebná místa s konjugátem kortizol-protein. Imunoreakce probíhá 10 min, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině kortizolu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 13,8 – 2208 nmol/l (vyšší koncentrace lze ředit sérem s nízkou hladinou kortizolu). Analytická citlivost 4,14 nmol/l, funkční citlivost 13,8 nmol/l. Preciznost v sérii 2,3 – 4,0 %, mezi sériemi 2,7 – 11,6 %. Linearita ředění je 84 – 109 %, zpětný výtěžek 89 – 106 %. Křížová reaktivita: hydroxyprogesteron 3,9 %, ostatní ≤ 1,6 %. Hemoglobin (10 g/l), bilirubin (342 µmol/l) a triacylglyceroly (33,9 mmol/l) neruší. Křížová reaktivita: prednisolon 12,6 %, 21-deoxykortizol 9,1 %, kortikosteron 3,5 %, 11-deoxykortizol 3,0 %, dexametazon 6,5 %, 17-α-hydroxyprogesteron 5,3 %, prednison 3,1 %, ostatní < 1,8 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Jiné stanovení CLIA je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Kortizol v prostředí pufrovaného roztoku soutěží s kortizolem značeným ALP o vazebná místa na polyklonální králičí protilátce imobilizované na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah měření je 28 - 1380 nmol/l. Všechny vzorky, jejichž koncentrace by mohla být mimo kalibrační rozmezí, je třeba naředit. Analytická citlivost 5,5 nmol/l. Preciznost v sérii 5,8 – 8,8 % %, celková 6,3 % – 10,0 %; linearita ředění 83 – 111%, zpětný výtěžek 102 – 117 %. Hemoglobin, bilirubin (342 µmol/l) a triacylglyceroly (33,9 mmol/l) neruší. Křížová reaktivita: prednisolon 49 %, metylprednisolon 23 %, kortikosteron 8,6 %, ostatní < 1 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující kortizol, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči králičímu kortizolu a konjugát kortizolu s ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství kortizolu. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 11 – 1655 nmol/l. (po ředění 2x nulovým kalibrátorem do 3300 nmol/l). Analytická citlivost 11 nmol/l. Preciznost v sérii 4,4 – 6,7 %, celkově 6,0 – 7,9 %. Linearita ředění je 92,3 – 121,3 %, zpětný výtěžek 93,7 – 111,5 %. Křížová reaktivita: 11-deoxykortizol 17,8 %, kortizon 8,1 %, prednisolon 7,6 %, 17-α-hydroxyprogesteron 5,3 %, prednison 3,1 %, ostatní ≤ 2,08 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Jiná chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení je, když kortizol ze vzorku soutěží s kortizolem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet vazebných míst biotinylované ovčí protilátky. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci (30 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě tříbodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci kortizolu ve vzorku. Rozsah měření 4,39 – 1700 nmol/l (vyšší koncentrace kortizolu jsou automaticky ředěné 2x). Analytická senzitivita 2,83 nmol/l, funkční senzitivita 4,39 nmol/l. Preciznost v sérii 1,7 – 2,6 %, mezi sériemi je 3,0 – 4,7 %. Hemoglobin interferuje při vyšetření. Bilirubin 171 µmol/l a triacylglyceroly 33,9 mmol/l nevadí. Křížová reaktivita: prednisolon 26,8 %, 6-metylprednisolon 5,94 %, fludrokortizon 3,85 %, 11-β-hydroxyprogesteron 2,52 %, ostatní < 1,1 %. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s biotinylovanou ovčí protilátkou vůči kortizolu a konjugátem derivátu kortizolu s ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu ve vzorku. Hemoglobin (19 g/l), triacylglyceroly (30,5 mmol/l), bilirubin (1026 µmol/l) a RF (< 1100 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,5 – 1750 nmol/l. Vyšší koncentrace - vzorky se ředí automaticky 10x (rozsah do 17500 nmol/l). Analytická citlivost 0,5 nmol/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 8,5 nmol/l. Preciznost v sérii CV 1,0 – 1,7 %, mezi sériemi 1,8 – 4,7 %; zpětný výtěžek 89 – 111 %. Křížová reakce: 6-α-prednisolon 389 %, prednisolon 171 %, allo-tetrahydrokortizol 165 %, 6- β-hydroxykortizol 158 %, 21-deoxykortizol 45,4 %, kortikosteron 5,8 %, 11-deoxykortizol 4,1 %, ostatní ≤ 1,5 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

CLIA detekce s elektroforetickou separací je kombinovaný postup, který začíná kompetitivní imunoreakcí kortizolu ze vzorku a kortizolu značeného křenovou peroxidázou o vazebná místa myší monoklonální protilátky vůči kortizolu. Volný kortizol a konjugát kortizol-POD jsou pak odděleny elektroforetickou separací na mikročipu za 60 s. Luminiscenční detekce se provádí reakcí peroxidázové značky s luminolem a H₂O₂. Rozsah měření je 9 – 900 nmol/l s detekčním limitem 4,2 nmol/l.

ID-GC/MS používají se dva postupy s derivatizací kortizolu na metyloxim-trimetylsilylderivát nebo heptafluorbutylderivát. Obě metody začínají přidáním konstantního množství vnitřního standardu 1α,2α-²H₂-kortizolu ke vzorku séra. Po 45 – 60 min ekvilibrace s endogenním kortizolem ze séra se látky izolují z alkalizované sérové matrice extrakcí do dichlormetanu. Odparek je vyčištěn chromatograficky (Sephadex LH-20). Po průchodu kolonou je mobilní fáze odpařena a pro účely GC/MS je odparek derivatizován (MOX-TMS nebo HBF) a měřen hmotnostním spektrometrem jako m/z 605/608 a 489/491. Preciznost v sérii byla 0,5 – 2,6 %. Pro referenční metodu je vnitřní standard 4-¹³C-kortizol.

HPLC vyžaduje extrakci kortizolu do dichlormetanu a rozpuštění odparku v kyselině sírové. Jako mobilní fáze se používá acetonitril s fosfátovým pufrem (pH 6,8). Kortizol se prokazuje  fluorescenční detekcí (390 nm excitace, 475 nm emise). Citlivost 13,8 nmol/l, CV 8,7 %.

Jiný postup HPLC umožňuje dělení přímo na koloně oxidu křemičitého (potažené diolem). Mobilní fáze je hexan – izopropylalkohol. Detekce UV 254 nm. Citlivost 4,4 nmol/l, CV 6,1 %.

Kortizol referenční standard: Certified Reference Materials ERM-DA451 z roku 2004 nebo SRM 921 z roku 1973.

Toleranční limit EHK: 16 %.

Snížené hodnoty: bolesti hlavy, centrální hypokorticismus, hypopituitarismus, hypotyreóza, Addisonova nemoc, krvácení, slepota, tuberkulóza; léky: aldakton, aminoglutetimid, androgeny, barbituráty, beklomet, beklometason, bekotid, betametason, danazol, deoxykortikosteron, dexametazon, dextróza, etomidát, fenytoin, levodopa, lithium, metylprednisolon, metyrapon, morfin, oxazepam, prednison (dlouhodobě), prednisolon (dlouhodobě), propranolol.

Zvýšené hodnoty: adenom nadledvin, silní kuřáci, hypertyreóza, Cushingův syndrom, deficit 21-hydroxylázy, elektrokonvulze, nádory produkující ACTH, malnutrice, obezita, po jídle, stres, těhotenství (3. trimestr), vynechávání menstruace; léky: ACTH, amfetaminy, tricyklická antidepresiva, estrogeny, etanol, éter, 11-deoxykortizol, 21-deoxykortizol,difenylhydantoin, fenobarbital, γ-interferon, glukagon, glukóza, interleukin-2, interleukin-6, karbamazepin, kokain, mepakrin, metoxamin, metoklopramid, metoprolol, naloxon, perorální kontraceptiva, prednisolon, prednison, spironolakton, vasopresin, verospiron.