Systematický název: pregn-4-en-3,20-dion, pregn-4-ene-3,20-dione, 4-pregnene-3,20-dione

progestin, progestogen, progesterol, crinone, endometrin, lipo-lutin

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin), případně ve slinách nebo moči. Nesmí být použity vzorky stabilizované azidem. Stabilita analytu 1 d při 20 – 25 °C (pokles za 168 h o 10 %), 5 – 14 d při 4 – 8 °C, 25 týdnů při -20 °C. Opakované zamrazení se nedoporučuje. Sérum lze zasílat poštou bez chlazení (do 24 h). Suchá kapka je stabilní při 25 °C 15 týdnů, při 37 °C 9 týdnů. Sliny jsou stabilní 5 dnů při pokojové teplotě, 10 d při 2 – 8 °C a dlouhodobě při -20 °C.

U fertilních žen závisí koncentraci na fázi menstruačního cyklu. Je vhodné uvést den cyklu.

RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 3 h za stálého třepání při laboratorní teplotě (nebo 1 h při 37 °C) s ¹²⁵I-progesteronem ve zkumavkách potažených králičí protilátkou vůči progesteronu. Pro vytěsnění progesteronu z bílkovin se používá danazol. Po inkubaci se obsah zkumavek dekantuje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci progesteronu ve vzorku. Rozsah měření na základě sedmibodové kalibrace 0,3 – 127 nmol/l. Analytická citlivost je 0,06 (0,1) nmol/l. Preciznost v sérii je 2,7 – 13,2 %, mezi sériemi 3,9 – 14,8 %; linearita ředění 85 -110 %, zpětný výtěžek 88 -111 %. Křížová reakce: 5α-pregnan-3,20-dion 9,0 %, ostatní ≤ 3,2 %. Lipémie ruší při stanovení.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který používá zakotvenou králičí protilátku vůči progesteronu a do jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor a progesteron značený POD. Po inkubaci (1 h, třepání) a promytí 3x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂ v dimetylsulfoxidovém pufru. Roztok se inkubuje 10 – 20 min (třepání), pak se pipetuje stop činidlo (1 M H₂SO₄). Absorbance při 450 nm se měří do 20 min a je nepřímo úměrná koncentraci progesteronu ve vzorku (při vysokých absorbancích lze použít 405 nebo 415 nm).  Celý postup probíhá za laboratorní teploty. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,32 – 190,8 nmol/l (při vyšších koncentracích se ředí nulovým kalibrátorem). Preciznost v sérii je 10,2 – 10,6 %, mezi sériemi 10,2 – 12,6 %; linearita ředění 81 – 110 %, zpětný výtěžek 78 – 124 %. Křížová reaktivita 11α-hydroxyprogesteronu je 100 %!, ostatní ≤ 1,7 %. Silná hemolýza, lipémie a ikterus ruší stanovení. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

K dispozici jsou i ELISA soupravy s mikrotitrační destičkou potaženou kozí protilátkou vůči králičímu IgG (k níž se připojí králičí protilátka vůči progesteronu) nebo s konjugátem progesteron-ALP a substrátem p-nitrofenylfosfátem.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a konjugát ovčích monoklonálních protilátek vůči progesteronu s ALP. Po inkubaci se přidají, latexové mikročástice potažené progesteronem, které obsadí zbylá volné místa protilátky. Poté se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím, zatímco imunokomplex s latexovými mikročásticemi se váže na skleněnou matrici. Po promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,64 – 127,2 nmol/l. Vzorky s hodnotami progesteronu 127,2 – 2544 nmol/l se ředí manuálně 20x. Analytická senzitivita je 0,64 nmol/l. Preciznost v sérii je 2,82 – 9,66 %, celková preciznost metody je 3,41 – 11,71 %. Zpětný výtěžek 98,7 – 101,1 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita: 5α-pregnan-3,20-dion 6,3 %, ostatní ≤ 3,2 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Kompetitivní reakce probíhá za laboratorní teploty mezi progesteronem ze vzorku a progesteronem, který je připojený na sběrný protein o vazebná místa na monoklonální protilátce vůči progesteronu značené Eu³⁺. Měřený signál je nepřímo úměrný koncentraci progesteronu. Analytická citlivost je 0,19 nmol/l, funkční citlivost 0,32 nmol/l. Komerční souprava už není dostupná.

DELFIA je kompetitivní heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena kozí protilátka vůči králičímu IgG. Do mikrotitračních destiček se pipetuje progesteron ze vzorku (a danazol k uvolnění progesteronu z bílkovin), polyklonální králičí protilátka a progesteron značený Eu³⁺ (inkubace 2 h, třepání, laboratorní teplota). Po promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je nepřímo úměrná koncentraci progesteronu ve vzorku a měří se do 1 h. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 0,8 – 120 nmol/l (při vyšších koncentracích lze ředit). Analytická citlivost je < 0,8 nmol/l. Lipémie ≥ 5 mmol/l a hemolýza ≥ 2 g/l ruší. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Chemiluminiscenční analýza v jednokrokovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči fluoresceinu, fluorescein a progesteron zakotvené na paramagnetických částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek a konjugát ovčích monoklonálních protilátek vůči progesteronu značený akridiniumkarboxamidem. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině progesteronu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,32 – 127,2 nmol/l (Vzorky s hodnotami progesteronu > 127,2 nmol/l lze automaticky 10x nebo manuálně ředit 10x, resp. 15x; po ředění musí být hodnota > 31,8 nmol/l). Preciznost v sérii je 1,5 – 5,5 %, celkově 2,1 – 6,2 %. Analytická senzitivita 0,32 nmol/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita: kortikosteron 4,6 %, ostatní < 4 %.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Myší monoklonální protilátka vůči progesteronu značená esterem akridinu se inkubuje spolu se vzorkem 2,5 min, pak se přidají paramagnetické latexové částice potažené derivátem progesteronu. Opět se inkubuje 5 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Vzorky s koncentrací progesteronu > 190,8 nmol/l se ředí automaticky 5x nebo 10x (koncentrace > 1908 nmol/l lze ředit manuálně). Analytická citlivost je 0,48 nmol/l. Preciznost v sérii 2,5 – 12,4 %, mezi sériemi 1,9 – 5,7 %. Linearita ředění je 97,9 – 118 %, zpětný výtěžek 76 – 109 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

CLIA je jednostupňový kompetitivní zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené protilátkou vůči progesteronu a progesteron ze vzorku soutěží o její vazebná místa s progesteronem značeným izoluminolem. Imunoreakce probíhá 21 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině progesteronu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 1,27 – 127,2 nmol/l (vyšší koncentrace lze ředit 10x). Analytická citlivost 1,27 nmol/l, funkční citlivost 3,18 nmol/l. Preciznost v sérii 4 – 9 %, mezi sériemi 6 – 15 %. Linearita ředění je 88 – 111 %, zpětný výtěžek 91 – 117 %. Křížová reaktivita: hydroxyprogesteron 3,9 %, ostatní ≤ 1,6 %. Hemolýza a bilirubin neruší; lipémie vadí.

Jiné stanovení je založeno na kompetitivní imunochemické reakci. Progesteron v prostředí pufrovaného roztoku soutěží s progesteronem značeným ALP o vazebná místa na polyklonální králičí protilátce imobilizované na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 minut při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření 425 – 500 nm je nepřímo úměrná koncentraci progesteronu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah měření je 0,6 - 127 nmol/l. Všechny vzorky, jejichž koncentrace by mohla být mimo kalibrační rozmezí, je třeba naředit. Analytická citlivost 0,3 nmol/l. Preciznost v sérii 7,0 – 17,4 % %, celková 9,5 % – 21,7 %; linearita ředění 86 – 134 %, zpětný výtěžek 73 – 111 %. Křížová reaktivita: 11-deoxykortikosteron 1,82 %, ostatní < 0,45 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující progesteron, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči králičímu progesteronu a konjugát progesteronu s ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství progesteronu. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,32 – 127,2 nmol/l. (po ředění 3x až do 381,6 nmol/l). Analytická citlivost 0,32 nmol/l. Linearita ředění je 102 – 121 %. Preciznost v sérii 6,11 – 11,19 %, mezi sériemi 7,51 – 9,57 %. Křížová reaktivita kortikosteron 6,08 %, ostatní ≤ 2,36 %. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky.

Chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení, kdy progesteron ze vzorku soutěží s progesteronem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet vazebných míst biotinylované králičí protilátky. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci (16 min) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci progesteronu ve vzorku. Rozsah měření 0,253 – 178 nmol/l (vyšší koncentrace progesteronu jsou automaticky ředěné 10x). Analytická senzitivita 0,085 nmol/l, funkční senzitivita 0,253 nmol/l. Preciznost v sérii 0,8 – 4,9 %, mezi sériemi je 3,1 – 10,7 %. Bilirubin 342 µmol/l a hemoglobin 5g/l neinterferují, lipémie nevadí. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Při reakci mohou interferovat heterofilní protilátky. Křížová reaktivita: 5α-pregnan-3,20-dion 5,2 %, 11-deoxykortikosteron 4,1 %, kortikosteron 3,3 %, ostatní < 2,5 %.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v kompetitivním uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči progesteronu. První reagencie (Chemibeads) je potažena derivátem progesteronu a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads. Progesteron ze vzorku soutěží s progesteronem na Chemibeads o omezené množství vazebných míst na biotinylované protilátce. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je nepřímo úměrný koncentraci progesteronu ve vzorku. Analýza trvá 21 min při 37 °C. Rozsah metody na základě pětibodové kalibrace je 0,636 – 127 nmol/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 5x, manuálně i více). Analytická citlivost je 0,64 nmol/l, funkční citlivost 1,59 nmol/l. Preciznost v sérii 1,3 – 4,8 %, mezi sériemi 1,8 – 6,3 %. Zpětný výtěžek 93 – 103 %. Hemolýza ani ikterus neruší. Lipemické vzorky poskytují falešně nižší výsledky.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (35 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči progesteronu, konjugátem derivátu progesteronu s ruthéniovým komplexem a danazolem (uvolnění progesteronu z bílkovin). Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci progesteronu ve vzorku. Hemoglobin, chylozita, ikterus a RF (< 2000 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,095 – 191 nmol/l. Vyšší koncentrace - vzorky se ředí manuálně 10x (rozsah do 1910 nmol/l). Analytická citlivost 0,095 nmol/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 0,48 nmol/l. Preciznost v sérii CV 1,1 – 2,9 %, mezi sériemi 1,8 – 5,5 %. Křížová reakce: 5β-dehydroprogesteron 20,7 %, ostatní ≤ 1,3 %. Ruší velmi vysoké hodnoty protilátek vůči streptavidinu a rutheniu. Při léčbě fenylbutazonem jsou výsledky falešně nižší.

Plynová chromatografie s plameno-ionizační detekcí nebo využitím detektoru elektronového záchytu je poměrně pracná metoda, která před nástřikem vyžaduje úpravu vzorku (extrakce a derivatizace).

GC-MS s izotopovou dilucí je doporučena jako referenční metoda (1991). Využívá se ester progesteronu a heptafluoromáselné kyseliny a jako vnitřní standard slouží [19-²H₃]-progesteron. Vzorek se opakovaně extrahoval do směsi n-hexan-CHCl₃ a progesteron se dělil v kapilární koloně 15 nebo 25 m. V MS se propojil magnetický sektor s kvadrupólovým spektrometrem a detekoval se m/z 510 progesteron a jeho trideuterovaný analog m/z 513. Preciznost v sérii je 1,65 – 1,75 %, mezi sériemi 2,08 – 2,16 %.

Další kandidátní metoda je izotopová diluce s LC/MS/MS (2006). Jako vnitřní standard byl použit progesteron¹³C₂. Separace byla provedena na koloně C₁₈ s mobilní fází v gradientu voda-acetonitril až čistý acetonitril při 30 °C. Hmotnostní spektrometr sledoval po elektrospreji při napětí 550 V a teplotě 600 °C přechod m/z 315,2 → 97,1 a u izotopového analogu 317,1 → 99,1. Preciznost v sérii je 0,1 – 1,4 %, mezi sériemi 0,3 – 0,5 %. Zpětný výtěžek byl 100,1 – 100,9 %. Detekční limit 1,8 pg.

Certifikované referenční materiály nesou označení CRM 347 a CRM 348

Toleranční limit EHK: 20 %.

Snížené hodnoty: amenorea, bulimie, masitá strava, vegetariánství, věk > 60 let, cvičení, hypertenze v důsledku těhotenství, postprandiálně; použití gelových separátorů; léky: ampicilin, cyklofosfamid, danazol, estriol, etinylprogesteron, interferon, perorální kontraceptiva, prostaglandin_F2α.

Zvýšené hodnoty: deficit 21-hydroxylázy, 11-alfa-hydroxylázy, 11-beta-hydroxylázy, nádory; léky: 11-deoxykortizol, dihydroprogesteron, 17-hydroxyprogesteron, ketokonazol, klomifen, kortikosteron, lysofosfatidylcholin, pregnangion, digoxin.