kortisol, hydrokortizon, hydrokortison;

cortisol, 11-epicortisol, epicortisol, hydrocortisone, 11-α-hydrocortisone, 9-β,10-α,11-α-hydrocortisone,

kortisol acetonid; (11β)-11-hydroxy-17,21-[(1-methylethyliden)bis(oxy)]-pregn-4-en-3,20-dion

Cortifair, Cortril, Cortef, Hydrocortone

Stanovení se provádí v moči nebo slinách.

Moč se sbírá kvantitativně 24 h do plastové nádobky s přídavkem HCl, H₃BO₃ nebo CH₃COOH. Během sběru je nádobka v lednici (2 – 8 °C).Stabilita okyselené moče při laboratorní teplotě je diskutabilní, při 2 – 8 °C 7 d, při -20 °C 4 týdny i více. Denní maximum 5 – 8 h, minimum 21 – 3 h, amplituda 180 – 200 %. U depresivních stavů jsou vysoké hladiny večer.

Při vyšetření slin za klidových podmínek je nezbytné sběr 2 až 3x opakovat. Maximum v 8 h, minimum ve 24 h. Sliny se nemusí před vyšetřením extrahovat, protože neobsahují vazebné proteiny ani metabolity kortizolu.

Vzorek moče se buď stanovuje přímo (s přídavkem nulového kalibrátoru) nebo po extrakci. Jestliže se extrahuje, pak do vychlazeného metylenchloridu a následně odstřeďuje v chlazené centrifuze. Horní vodná vrstva se opatrně odstraní (metylenchloridový extrakt lze skladovat při 2 – 8 °C 7 d). Extrakt se odpaří při 35 – 40 °C pod slabým proudem dusíku. Odparek se rozpustí v nulovém kalibrátoru a stanoví se kortizol. RIA je kompetitivní postup, kdy vzorky a kalibrátory jsou inkubovány 1 h za stálého třepání při laboratorní teplotě s ¹²⁵I-kortizolem ve zkumavkách potažených monoklonální myší protilátkou vůči kortizolu. Po inkubaci se obsah zkumavek dekantuje a měří se radioaktivita gama-počítačem (1 min). Signál je nepřímo úměrný koncentraci kortizolu ve vzorku. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace 5 – 2000 nmol/l. Analytická citlivost je 5 nmol/l. Preciznost v sérii je 8,9 – 9,4 %, mezi sériemi 12,6 – 13,3 %; linearita ředění 80,1 – 118 %, zpětný výtěžek 82,6 – 119 %. U pacientů, léčených vysokými dávkami těchto léků může docházet ke zvýšení hladin kortizolu v moči a séru v důsledku vlivu samotných léčiv nebo jejich metabolitů.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, který nevyžaduje předchozí extrakci moče. Používá zakotvenou protilátku vůči kortizolu a do jamek se přidává vzorek nebo kalibrátor a kortizol značený POD. Po inkubaci (60 min, 37 °C, třepání) a promytí 2x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂. Roztok se inkubuje 15 min (laboratorní teplota, třepání ve tmě), pak se pipetuje stop činidlo (0,15 M H₂SO₄). Absorbance při 450 nm se měří do 5 min a je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu ve vzorku. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 5,5 – 1380 nmol/l. Preciznost v sérii je 7,4 %, mezi sériemi 7,9 %; zpětný výtěžek 97,9 – 112,1 %. Křížová reaktivita: 11-deoxykortizol 18,7 %, kortizon 10,8 %, kortikosteron 2,4 %, dexametazon 0,39 %, ostatní < 0,11 %.

FPIA Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze. Vzorek se pipetuje spolu s fosfátovým pufrem, myší monoklonální a kozí polyklonální protilátkou vůči kortizolu. Po změření blanku se přidá kortizol značený fluoresceinem. Po inkubaci se měří fluorescence (excitace 490 nm, emise 517 nm), která je nepřímo úměrná množství kortizolu. Rozsah kalibrace na základě šesti kalibrátorů 30,4 – 1656 nmol/l (vyšší koncentrace kortizolu lze ředit manuálně 2x). Analytická senzitivita 30,4 nmol/l. Preciznost v sérii je 5,3 – 13,9 %, celkově 6,1 – 15,0 %. Linearita ředění je 94,9 – 110,5 %, zpětný výtěžek 92,6 – 100,4 %. Křížová reaktivita: prednisolon 32,2 %, 11-deoxykortizol 13,6 %, kortikosteron 8,0 %, dexametazon 2,0 %, ostatní < 1,5 %.

Chemiluminiscenční analýza v dvoukrokovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči kortizolu, zakotvené na paramagnetických částicích, ke kterým se přidává standard nebo vzorek. Po inkubaci se přidá konjugát kortizolu s akridiniumkarboxamidem. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je nepřímo úměrná hladině kortizolu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 11 – 1650 nmol/l (Vzorky s hodnotami kortizolu > 1650 nmol/l lze automaticky 2x nebo manuálně ředit 4x; po ředění musí být hodnota > 82,8 nmol/l). Analytická citlivost 11 nmol/l.  Preciznost v sérii je 2,1 – 6,1 %, celkově 2,5 – 7,7 %. Křížová reaktivita: fludrokortizon 36,6 %, prednisolon 12,3 %, kortizon 2,7 %, ostatní < 2 %.

Vzorek moče se extrahuje do vychlazeného metylenchloridu a odstřeďuje v chlazené centrifuze. Horní vodná vrstva se opatrně odstraní (metylenchloridový extrakt lze skladovat při 2 – 8 °C 7 d). Extrakt se odpaří při 35 – 40 °C pod slabým proudem dusíku. Odparek se rozpustí v rekonstitučním pufru a stanoví se kortizol. Kortizol značený esterem akridinu se inkubuje spolu se vzorkem 2,5 min a paramagnetickými latexovými částicemi s kovalentně připojenou monoklonální myší protilátkou vůči králičímu IgG, na kterou je navázaná králičí polyklonální protilátka vůči kortizolu. Směs se inkubuje 5 min. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm. Rozsah kalibrace na základě dvou standardů je 5,5 – 2069 nmol/l. Luminiscence záblesku je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu. Vzorky s koncentrací kortizolu > 2069 nmol/l se ředí automaticky 2x nebo manuálně podle potřeby. Analytická citlivost je 5,5 nmol/l. Preciznost v sérii 2,9 – 3,7 %, mezi sériemi 1,9 – 5,5 %. Linearita ředění je 86,2 – 114 %, zpětný výtěžek 88,2 – 113 %. Křížová reaktivita: prednisolon 109 %, prednison 34 %, kortizon 31,1 %, 6-metylprednisolon 26,2 %, 11-deoxykortizol 23,3 %, 21-deoxykortizol 8,1 %, 6-β-hydroxykortizol 6,8 %, allo-tetrahydrokortizol 6,5 %, kortikosteron 5,3 %, ostatní < 2 %.

Vzorek moče se extrahuje do vychlazeného metylenchloridu a odstřeďuje v chlazené centrifuze. Horní vodná vrstva se opatrně odstraní (metylenchloridový extrakt lze skladovat při 2 – 8 °C 7 d). Extrakt se odpaří při 35 – 40 °C pod slabým proudem dusíku. Odparek se rozpustí v rekonstitučním pufru a stanoví se kortizol. CLIA (SPALT = Solid Phase Antigen Linked Technique) je jednostupňový kompetitivní zábleskový postup. Magnetické částice jsou potažené konjugátem proteinu a kortizolu. Monoklonální myší protilátka vůči kortizolu je značená izoluminolem. Kortizol ze vzorku soutěží o její vazebná místa s konjugátem kortizol-protein. Imunoreakce probíhá 10 min, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině kortizolu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 13,8 – 2208 nmol/l (vyšší koncentrace lze ředit sérem s nízkou hladinou kortizolu). Analytická citlivost 4,14 nmol/l, funkční citlivost 13,8 nmol/l. Preciznost v sérii 2,3 – 4,0 %, mezi sériemi 2,7 – 11,6 %. Linearita ředění je 84 – 109 %, zpětný výtěžek 89 – 106 %. Křížová reaktivita: hydroxyprogesteron 3,9 %, ostatní ≤ 1,6 %. Křížová reaktivita: prednisolon 12,6 %, 21-deoxykortizol 9,1 %, kortikosteron 3,5 %, 11-deoxykortizol 3,0 %, dexametazon 6,5 %, 17-α-hydroxyprogesteron 5,3 %, prednison 3,1 %, ostatní < 1,8 %.

Další postup používá luminogen Lumi-Phos 530. Před analýzou moče je třeba kortizol ze vzorku extrahovat do etylacetátu, centrifugovat, odsát horní vrstvu (etylacetátovou), odpařit v mírném proudu dusíku nebo vzduchu a rozpustit v nulovém kalibrátoru.  Do zkumavky se pipetuje standard nebo upravený vzorek obsahující kortizol, paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči králičímu kortizolu a konjugát kortizolu s ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství kortizolu. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 11 – 1655 nmol/l. (po ředění 2x nulovým kalibrátorem do 3300 nmol/l). Analytická citlivost 11 nmol/l. Linearita ředění je 92,3 – 121,3 %, zpětný výtěžek 93,7 – 111,5 %. Preciznost v sérii 4,4 – 6,7 %, celkově 6,0 – 7,9 %. Křížová reaktivita: 11-deoxykortizol 17,8 %, kortizon 8,1 %, prednisolon 7,6 %, 17-α-hydroxyprogesteron 5,3 %, prednison 3,1 %, ostatní ≤ 2,08 %.

Vzorek moče se extrahuje do vychlazeného metylenchloridu a odstřeďuje v chlazené centrifuze. Horní vodná vrstva se opatrně odstraní (metylenchloridový extrakt lze skladovat při 2 – 8 °C 7 d). Extrakt se odpaří při 35 – 40 °C pod slabým proudem dusíku. Odparek se rozpustí v rekonstitučním pufru a stanoví se kortizol. Chemiluminiscenční analýza v kompetitivním provedení, kdy kortizol ze vzorku soutěží s kortizolem značeným křenovou peroxidázou o omezený počet vazebných míst biotinylované ovčí protilátky. Imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem. Po inkubaci (30 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě tříbodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci kortizolu ve vzorku. Rozsah měření 4,39 – 1700 nmol/l. Analytická senzitivita 2,83 nmol/l, funkční senzitivita 4,39 nmol/l. Preciznost v sérii 6,9 – 23,4 %, mezi sériemi je 9,3 – 29,5 %. Křížová reaktivita: prednisolon 26,8 %, 6-metylprednisolon 5,94 %, fludrokortizon 3,85 %, 11-β-hydroxyprogesteron 2,52 %, ostatní < 1,1 %. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání.

Vzorek moče se extrahuje do vychlazeného metylenchloridu a odstřeďuje v chlazené centrifuze. Horní vodná vrstva se opatrně odstraní (metylenchloridový extrakt lze skladovat při 2 – 8 °C 7 d). Extrakt se odpaří při 35 – 40 °C pod slabým proudem dusíku. Odparek se rozpustí v rekonstitučním pufru a stanoví se kortizol. Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v kompetitivním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s biotinylovanou ovčí protilátkou vůči kortizolu a konjugátem derivátu kortizolu s ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a imunokomplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná koncentraci kortizolu ve vzorku. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,5 – 1750 nmol/l. Vyšší koncentrace - vzorky se ředí automaticky 10x (rozsah do 17500 nmol/l). Analytická citlivost 0,5 nmol/l, funkční citlivost (CV ≤ 20 %) je 8,5 nmol/l. Preciznost (po extrakci) v sérii CV 2,2 – 2,9 %, mezi sériemi 1,4 – 2,8 %; zpětný výtěžek 89 – 111 %. Křížová reakce: 6-α-prednisolon 389 %, prednisolon 171 %, allo-tetrahydrokortizol 165 %, 6- β-hydroxykortizol 158 %, 21-deoxykortizol 45,4 %, kortikosteron 5,8 %, 11-deoxykortizol 4,1 %, ostatní ≤ 1,5 %.

ID-GC/MS používají se dva postupy s derivatizací kortizolu na metyloxim-trimetylsilylderivát nebo heptafluorbutylderivát. Obě metody začínají přidáním konstantního množství vnitřního standardu 1α,2α-²H₂-kortizolu ke vzorku moče. Po 45 – 60 min ekvilibrace s endogenním kortizolem z moče séra se látky izolují extrakcí do dichlormetanu. Odparek je vyčištěn chromatograficky (Sephadex LH-20). Po průchodu kolonou je mobilní fáze odpařena a pro účely GC/MS je odparek derivatizován (MOX-TMS nebo HBF) a měřen hmotnostním spektrometrem jako m/z 605/608 a 489/491. Preciznost v sérii byla 0,5 – 2,6 %. Pro referenční metodu je vnitřní standard 4-¹³C-kortizol.

HPLC vyžaduje extrakci kortizolu do dichlormetanu a rozpuštění odparku v kyselině sírové. Jako mobilní fáze se používá acetonitril s fosfátovým pufrem (pH 6,8). Kortizol se prokazuje  fluorescenční detekcí (390 nm excitace, 475 nm emise). Citlivost 13,8 nmol/l, CV 8,7 %.

Jiný postup umožňuje dělení přímo na koloně oxidu křemičitého (potažené diolem). Mobilní fáze je hexan – izopropylalkohol. Detekce UV 254 nm. Citlivost 4,4 nmol/l, CV 6,1 %.

Kortizol referenční standard: Certified Reference Materials ERM-DA451 z roku 2004 nebo SRM 921 z roku 1973.

Snížené hodnoty: centrální hypokorticismus, hypopituitarismus, hypotyreóza, Addisonova nemoc, krvácení, tuberkulóza; léky: aldakton, aminoglutetimid, androgeny, barbituráty, beklomet, beklometason, bekotid, betametason, danazol, dexametazon, dextróza, DHEA (moč), edekrin (moč), efedrin (moč), etomidát, fenytoin, hydrochlorothiazid (moč), ketokonazol (moč), levodopa, lithium, metylprednisolon, metyrapon, morfin, oxazepam, prednison (dlouhodobě), prednisolon (dlouhodobě), propranolol.

Zvýšené hodnoty: adenom nadledvin, silní kuřáci, hypertyreóza, Cushingův syndrom, nádory produkující ACTH, obezita, po jídle, stres, těhotenství (3. trimestr); léky: ACTH, amfetaminy, tricyklická antidepresiva, estrogeny, etanol, éter, γ-interferon, glukóza, hyperstat (moč), karbamazepin, mepakrin, metoxamin, metoklopramid, metoprolol, naloxon, nutramin (moč), perorální kontraceptiva, prednisolon, prednison, spironolakton, tetracykliny,vasopresin, verospiron.