tacrolimus, tacarolimus, Tac

3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)], 4S*, 5R*, 8S*, 9E, 12R*, 14R*, 15S*, 16R*, 18S*, 19S*, 26aR*-5, 6, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 24, 25, 26, 26a-hexadekahydro-5, 19-dihydroxy-3-[2-(4-hydroxy-
 3-methoxycyklohexyl)-1-methylethenyl]-14, 16-dimethoxy-4, 10, 12, 18-tetramethyl-8-(2-propenyl)-15, 19-epoxy-
3H-pyrido[2,1-c] [1,4] oxaazacyklotrikosin-1,7,20,21(4H,23H) -tetron monohydrát

Advagraf, Prograf, Protopic, Fujimycin, FK 506

Odběr 12 h po poslední dávce a bezprostředně před další dávkou. Stanovení se provádí v celé krvi (antikoagulans EDTA).
Stabilita vzorku 18 – 25 °C: 8 h, 4 – 8 °C: 7 dnů, -20 °C: 6 měsíců. Biologický poločas 21 (10 -14) h, rovnovážný stav za 2 – 3 dny.

Imunochemické postupy jsou nejběžnější, HPLC/MS/MS slouží spíše pro srovnávací studie.

ELISA postup v kompetitivním uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči takrolimu. Mikrotitrační destička má jamky potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG. Po extrakci lyzačním činidlem a odstředění se přidá supernatant vzorku a poté monoklonální myší protilátka vůči takrolimu. Po inkubaci 20 min za laboratorní teploty se přidá konjugát takrolimu s křenovou peroxidázou a následuje další 60 min inkubace. Po promytí jamek se přidá chromogen a barevná reakce se zastaví po 15 min kyselinou sírovou. Absorbance se měří bichromaticky při 460 proti 630 nm a zbarvení je nepřímo úměrné koncentraci takrolimu ve vzorku. Analytická citlivost 0,35 nmol/l. Rozsah metody je do 130 nmol/l. Preciznost CV 7,4 – 24,8 %, přesnost -10 až +53 %; výtěžnost 78 – 84 %.
Heterogenní enzymová analýza: Vzorek nejprve reaguje s lyzačním činidlem (síran měďnatý). Pak se váže na konjugát protilátky vůči takrolimu s navázanou β-galaktosidázou. Zbytek volných míst protilátky vůči takrolimu obsadí takrolimus imobilizovaný na částice oxidu chromičitého. Po dosažení rovnováhy se imunokomplex na částicích odstraní magnetickou separací. V supernatantu je původní imunokomplex s β-galaktosidázou, který se převede do reakční kyvety obsahující chlorfenolovou červeň s navázaným β-d-galaktopyranosidem, který je enzymovým markerem rozštěpen na chlorfenolovou červeň, absorbující při 577 nm. Nárůst absorbance se sleduje bichromaticky (577 proti 700 nm) a je přímo úměrný koncentraci takrolimu ve vzorku. Rozsah metody je 1,56 – 39 nmol/l. Analytická citlivost metody je 1,56 nmol/l, funkční citlivost 3,12 nmol/l. Preciznost dosáhla
v sérii CV 1,5 – 10,7 %, celkem 2,1 – 11,6 %. Výtěžnost je 94,1 – 99,1 %.
Před postupem EMIT se vzorky, kalibrátory a kontrolní materiály upraví lyzačním činidlem (síran měďnatý)
a metanolem. Krevní bílkoviny se vysráží, extrakt se centrifuguje a supernatant se použije k analýze. Homogenní enzymová imunoanalýza EMIT používá při kompetitivní reakci o monoklonální myší protilátku vůči takrolimu analyt ze vzorku a konjugát takrolimu s rekombinantní glukóza-6-fosfátdehydrogenázou. Volný konjugát přeměňuje NAD⁺ na NADH a sleduje se nárůst absorbance při 340 nm, která je přímo úměrná koncentraci takrolimu. Endogenní glukóza-6-fosfátdehydrogenáza neinterferuje, protože NAD⁺ reaguje
s bakteriálním enzymem použitým v soupravě. Rozsah metody 2,6 – 39 nmol/l. Analytická citlivost 2,6 mmol/l, funkční citlivost 3,64 µg/l. Preciznost CV v sérii 3,4 – 7,8 %, celkem 6,8 – 16,4 %; výtěžnost 106 – 110 %.
CEDIA je homogenní enzymová imunoanalýza, která využívá rekombinantní DNA technologie, kdy donor
a akceptor enzymu po spojení vytvoří aktivní β-galaktosidázu, která reaguje s galaktopyranosidovým substrátem za vzniku barevného produktu. Takrolimus ze vzorku a takrolimus značený donorem soutěží
o specifickou protilátku. Protilátka vůči takrolimu zabraňuje vzniku aktivního enzymu (spojení donoru
s akceptorem). Čím více je takrolimu ve vzorku, tím více konjugátu donoru enzymu s takrolimem zůstane
ve volné formě a může se spojit s akceptorem na aktivní enzym, takže výsledná absorbance je přímo úměrná množství takrolimu ve vzorku. Analytická citlivost byla 1,04 nmol/l. Rozsah metody je do 39 nmol/l. Preciznost měla CV 6,3 – 20,6 %, výtěžnost 100 – 112,2 %.
MEIA postupu předchází úprava vzorku krve extrakčním činidlem (síran zinečnatý v metanolu a etylenglykolu)
a odstředění. Supernatant se pipetuje do jamky a přidají se mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči takrolimu a poté konjugát takrolimu s ALP. Dochází k soutěži takrolimu ze vzorku a z konjugátu
o vazebná místa na specifické protilátce. Reakční směs se převede na fritu ze skleněných vláken, kde se mikročástice zachytí. Substrát se ALP defosforyluje na 4-metylumbeliferon a současně se promývacím roztokem vymyje volný takrolimus z plochy, kde je měřena fluorescence (plocha s imobilizovanou protilátkou). 4-Metylumbeliferon vytvořený ALP je fluorochrom. Intenzita fluorescence (excitace 485, emise 525 – 550 nm) je nepřímo úměrná koncentraci takrolimu ve vzorku a je měřena fluorimetrem. Analytická citlivost 1,97 nmol/l. Rozsah metody do 39 nmol/l. Preciznost v sérii dosahuje CV celkem 5,4 – 17,4 %, přesnost +3 až +27 %; výtěžnost 84 – 97 %.
Před zahájením chemiluminiscenční analýzy je vzorek krve extrahován precipitačním činidlem (roztok síranu zinečnatého v metanolu a etylenglykolu) a odstředěn. Supernatant se použije pro chemiluminiscenční analýzu s esterem akridinu jako značkou. Principem stanovení je sekvenční imunoanalýza. Supernatant se smíchá
s EDTA pufrem a paramagnetickými mikročásticemi potaženými myší monoklonální protilátkou vůči takrolimu. Obsadí se část vazebných míst specifické protilátky a poté se do reakční směsi přidá konjugát takrolimu
s esterem akridinu v citrátovém pufru, který obsadí zbylá dostupná vazebná místa na mikročásticích. Po inkubaci se mikročástice promyjí fosfátovým pufrem a do reakční směsi se přidají roztoky peroxidu vodíku
a hydroxidu sodného. Množství takrolimu ve vzorku je nepřímo úměrné chemiluminiscenci. Heterofilní protilátky
v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích. Vzorky od pacientů, kteří jsou běžně vystaveni kontaktu se zvířaty nebo s produkty ze zvířecího séra, mohou být k této interferenci náchylné
a mohou u nich být naměřeny anomální hodnoty. Vzorky od pacientů, kterým byly z diagnostických nebo terapeutických důvodů aplikovány preparáty obsahující myší monoklonální protilátky, mohou obsahovat lidské anti-myší protilátky (HAMA). Vzorky obsahující HAMA mohou poskytovat anomální hodnoty. Rozsah metody 2,6 –
39 nmol/l. Analytická citlivost 0,39 nmol/l, funkční citlivost 2,6 nmol/l. Preciznost CV v sérii 2,4 – 5,0 %, celkem 3,5 – 6,7 %. Odezva na linearitu byla 98 – 108 %. Výtěžnost byla 98 – 107 %.

HPLC/MS/MS s elektrosprejí předchází předběžná úpravy deproteinací síranem zinečnatým a následná extrakce do acetonitrilu a poté izokratická chromatografie na koloně, kdy je vzorek vymýván mravenčanem amonným v metanolu (+0,1 % kyseliny mravenčí). Detekuje se primární ion m/z 821,4 a dceřiné ionty m/z 576,2 a 768,4. Vnitřní standardem byl askomycin s primárním iontem m/z 809,4 a dceřinými ionty m/z 564,2 a 756,3. Rozsah metody je 0,65–193,4 nmol/l. Reprodukovatelnost dosáhla CV v sérii 2,04 – 4,37 %, mezi sériemi
1,37 – 2,55 %, celkem 2,46 – 7,04 %; výtěžnost 90,9 – 97,9 %. Celková analytická chyba 6,44 – 18,56 % (podle koncentrace). Metoda je navrhována jako referenční.

Mezinárodní standard oficiálně neexistuje i když jeden čínský výrobek nese označení standardní referenční materiál a k dispozici jsou preparáty s čistotou > 99 %.

Výsledky stanovení takrolimu snižuje: ethotoin, fenobarbital, fenytoin, karbamazepin, mefenytoin, primidon, rifabutin, rifampin, trimethoprim-sulfa (intravenózně), aj.
Výsledky stanovení takrolimu zvyšují: bromokriptin, cimetidin, cisaprid, cyklosporin, danazol, ditiazem, erythromycin, flukonazol, itrakonazol, klarithromycin, ketokonazol, klotrimazol, methylprednisolon, proteázové inhibitory, metoklopramid, nikardipin, nifedipin, troleandomycin, verapamil, aj.