Haemophilus pertussis

Stanovení nebo průkaz se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans citronan). Odběr krve se provádí ráno nalačno, nezbytný je i následný odběr do 30 dnů. Stabilita při 15 – 25 °C 2 d, při 2 – 8 °C 5 d, při -20 °C 1 rok. Pro aglutinační testy je třeba vyloučit vzorky hemolytické a chylosní. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.

Aglutinace – pro kvalitativní test na reagenčním proužku se využívá polyklonální králičí antisérum. Reakce při jemném kroužení je ukončena za 1 min. Silný zákal se objevuje při nízké koncentraci mikroorganismu, zatímco při vyšších koncentracích je slabší (hodnocení na 1 – 4 kříže). Při negativní reakci se zákal neobjevuje.

Fixace komplementu je kvalitativní test, při kterém řada malých bílkovin reaguje s komplexem antigenu Bordetella pertussis a jeho protilátek. Napřed se tepelně denaturuje komplement séra a přidá se standardní množství prasečího komplementu. Dále se přidá Bordetella pertussis a inkubuje se přes noc při 4 °C. Jestliže nejsou přítomné protilátky vůči tomuto mikroorganismu, dochází k lýze přidaných ovčích erytrocytů komplementem a vzniká růžové zbarvení. Pokud jsou protilátky přítomné, vytvoří imunokomplex s plísní Aspergillus a ten vyváže komplement a vzniká sraženina. Proto nedochází k lýze ovčích erytrocytů (volný komplement není v dispozici). 

Imunoblot umožňuje průkaz protilátek IgG, IgA nebo IgM komerčními soupravami po elektroforéze. Současně lze prokázat jak Bordetella pertussis tak Bordetella parapertussis.

Postup imunoblotu bez elektroforézy umožňuje průkaz pouze Bordetella pertussis IgG, IgA nebo IgM. Postup se provádí za laboratorní teploty. Proužek s ukotveným antigenem reaguje se specifickou protilátkou ze séra (30 min, třepání). Po trojnásobném promytí pufrem se přidá konjugát příslušného kozího antiséra (proti lidskému IgG, IgA nebo IgM) s ALP a inkubuje 15 min (třepání). Po trojnásobném promytí pufrem se proužek vymyje destilovanou vodou a přidá se substrát a inkubuje 7 – 15 min (třepání). Po trojnásobném promytí pufrem se proužek vysuší a interpretuje.

ELISA – IgG: Mikrotitrační destičky jsou potaženy IgG antigenem Bordetella pertussis. Po přidání kontrol nebo vzorků se provede imunoreakce 1 h při 37 °C. Po trojnásobném promytí a odsátí promývacího roztoku se přidá konjugát anti-IgG s křenovou peroxidázou. Další inkubace je 30 min za laboratorní teploty bez přímého slunečního světla. Po trojnásobném promytí a odsátí promývacího roztoku se přidá tetrametylbenzidin a inkubuje se přesně 15 min za laboratorní teploty ve tmě. Po přidání stop činidla (0,2 M H₂SO₄) se měří při 450 nm (u vysokých koncentrací mikroorganismu může vzniknout černá sraženina a doporučuje se kromě běžného ředění vzorku 100x ředit takto naředěný vzorek ještě 2x fosfátovým pufrem) do 30 min, případně bichromaticky 450/620 nm. Výsledky se na základěhodnot absorbance negativní a pozitivní kontroly interpretují kvalitativně. Preciznost v sérii je 3,9 – 5,2 %, mezi sériemi 4,9 – 6,1 %. Specifita testu je 94 %, senzitivita 97,4 %. Při testu neruší hemoglobin 10 g/l, triacylglyceroly 5,6 mmol/l, bilirubin 342 µmol/l.   

ELISA – IgA: Mikrotitrační destičky jsou potaženy IgA antigenem Bordetella pertussis. Po přidání kontrol nebo vzorků se provede imunoreakce 1 h při 37 °C. Po trojnásobném promytí a odsátí promývacího roztoku se přidá konjugát anti-IgA s křenovou peroxidázou. Další inkubace je 30 min za laboratorní teploty bez přímého slunečního světla. Po trojnásobném promytí a odsátí promývacího roztoku se přidá tetrametylbenzidin a inkubuje se přesně 15 min za laboratorní teploty ve tmě. Po přidání stop činidla (0,2 M H₂SO₄) se měří při 450 nm (u vysokých koncentrací mikroorganismu může vzniknout černá sraženina a doporučuje se kromě běžného ředění vzorku 100x ředit takto naředěný vzorek ještě 2x fosfátovým pufrem) do 30 min, případně bichromaticky 450/620 nm. Výsledky se na základěhodnot absorbance negativní a pozitivní kontroly interpretují kvalitativně. Preciznost v sérii je 4,9 – 7,1 %, mezi sériemi 5,18 – 6,94 %. Specifita testu je > 90 %, senzitivita 93 %. Při testu neruší hemoglobin 10 g/l, triacylglyceroly 5,6 mmol/l, bilirubin 342 µmol/l.   

ELISA – IgM: Mikrotitrační destičky jsou potaženy IgM antigenem Bordetella pertussis. Po přidání kontrol nebo vzorků se provede imunoreakce 1 h při 37 °C. Po trojnásobném promytí a odsátí promývacího roztoku se přidá konjugát anti-IgM s křenovou peroxidázou. Další inkubace je 30 min za laboratorní teploty bez přímého slunečního světla. Po trojnásobném promytí a odsátí promývacího roztoku se přidá tetrametylbenzidin a inkubuje se přesně 15 min za laboratorní teploty ve tmě. Po přidání stop činidla (0,2 M H₂SO₄) se měří při 450 nm (u vysokých koncentrací mikroorganismu může vzniknout černá sraženina a doporučuje se kromě běžného ředění vzorku 100x ředit takto naředěný vzorek ještě 2x fosfátovým pufrem) do 30 min, případně bichromaticky 450/620 nm. Výsledky se na základěhodnot absorbance negativní a pozitivní kontroly interpretují kvalitativně. Preciznost v sérii je 8,5 – 14 %, mezi sériemi 8,2 – 9,4 %. Specifita testu je > 95 %, senzitivita 84,2 %. Při testu neruší hemoglobin 10 g/l, triacylglyceroly 5,6 mmol/l, bilirubin 342 µmol/l.

PCR může také sloužit k průkazu Bordetella pertussis. Postup je založený na amplifikaci sekce IS481 vsunuté sekvence a potvrzení pozitivních výsledků na sekvenci v oblasti promotéru pertussinového toxinu. Specifita testu je 93 %, senzitivita 97 %.

Interference nejsou v dostupné literatuře uvedené.