anti-HAV IgM, HAV IgM antibodies, HAVAB IgM, HAVAb IgM

Stanovení se provádí v séru (plazmě). Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 1 d při doporučené teplotě 4°C. Sérum je stabilní při 18 – 26 °C 4 – 24 h, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců.

Všechny typy souprav jsou pouze pro kvalitativní stanovení.

RIA analýza se používá již omezeně, i když stále existují komerční soupravy na trhu. Obvykle se sleduje kompetitivní reakce mezi anti-HAV ze séra a anti-HAV značenými ¹²⁵I o vazebná místa na viru hepatitidy A, který je vázaný na stěně zkumavky. Radioaktivita je po vymytí nepřímo úměrná množství anti-HAV v séru. Anti-HAV IgM se zablokuje kozí protilátkou vůči lidskému IgM. Je-li pokles měřené radioaktivity ≥ 30 %, je existence anti-HAV IgM prokázaná. K dispozici jsou i soupravy na principu IRMA, které ale nejsou blíže specifikovány.

ELISA (nekompetitivní princip) používá mikrotitrační destičky se zakotvenou kozí polyklonální protilátkou (jiná souprava: monoklonální myší protilátka) vůči lidskému IgM. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek. Pak se přidá HAV (z lidských fibroplastů) Imunoreakce (soutěž o volná místa HAV) se provádí 60 min při 37 °C, roztok se odsaje a jamky se 4x promyjí; přidá se myší monoklonální protilátka vůči HAV označená křenovou peroxidázou a roztok se inkubuje 60 min (120 min) při 37 °C. Po promytí 4x se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 30 min ve tmě při 18 – 25 °C) a následně stop činidlo (1 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min a signál je přímo úměrný koncentraci anti-HAV IgM. Vzorky s absorbancí cut-off -10 % jsou negativní, s absorbancí cut-off +10 % pozitivní a mezi těmito hodnotami hraniční. Preciznost v sérii 3,2 – 15,0 % (6,8 – 8,9 %), mezi sériemi 4,9 – 30,5 % (10,0 – 12,5 %). Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Relativní senzitivita je 99,2 % (98,3 %), relativní specificita 99,4 % (97,9 %). Antikoagulancia (heparin, EDTA, citrát) stanovení neovlivňují.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se na fritu dávkují latexové mikročástice potažené kozími protilátkami vůči lidskému IgM a poté vzorek ředěný TRIS pufrem. Přidá se lidský HAV ve fosfátovém pufru a konjugát myších monoklonálních protilátek vůči HAV značený ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je přímo úměrná anti-HAV IgM. Jednobodová kalibrace (v dubletu) slouží pro kvalitativní hodnocení. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) > 1,20 jsou reaktivní na anti-HAV IgM, < 0,80 jsou nereaktivní, 0,80 – 1,20 jsou reaktivní v šedé zóně (vyšetření opakovat v týdenních intervalech). Preciznost v sérii je 3,2 – 7,0 %, mezi sériemi 4,1 – 8,5 %. Relativní senzitivita je 97,7 %, relativní specificita 99,3 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá lidský virus hepatitidy A zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči lidskému IgM značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HAV IgM a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Jednobodová kalibrace (v tripletu) slouží pro kvalitativní hodnocení. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) > 1,20 jsou reaktivní na anti-HAV IgM, < 0,80 jsou nereaktivní, 0,80 – 1,20 jsou reaktivní v šedé zóně (vyšetření opakovat v týdenních intervalech).  Preciznost v sérii je 5,9 – 11,33 %, mezi sériemi 6,6 – 13,1 %. Relativní senzitivita je 95 %, relativní specificita 98 %. Silná hemolýza ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Vzorek se naředí diluentem s kozím sérem. Ředěný vzorek se pipetuje do kyvety spolu s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM. Po inkubaci 6 min při 37 °C se přidají paramagnetické latexové částice potažené streptavidinem. Po druhé inkubaci 18 min při 37 °C se roztok odsaje a promyje. Částice se resuspendují ve fosfátovém pufru (6,7 min při 37 °C). Dále se přidá HAV a monoklonální myší anti-HAV F(ab)₂ fragment značený esterem akridinu. Při třetí inkubaci (18 min při 37 °C) se na částice připojí imunokomplex. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství anti-HAV IgM) fotonásobičem při 429 nm. Provádí se dvoubodová kalibrace. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / cut-off) > 1,20 jsou reaktivní na anti-HAV IgM, < 0,80 jsou nereaktivní, 0,80 – 1,20 jsou reaktivní v šedé zóně (vyšetření opakovat v týdenních intervalech). Preciznost v sérii je 3,7 – 8,7 %, mezi sériemi 2,3 – 6,5 %. Relativní senzitivita je 96,2 %, relativní specificita 99,4 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují < 10 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další sendvičový dvojstupňový zábleskový postup, kdy anti-HAV IgM ze vzorku se naváže během první inkubace (10 min) na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči lidskému IgM. Po promytí se přidá lidský HAV a monoklonální myší protilátka vůči HAV značená izoluminolem a proběhne další inkubace (10 min). Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HAV IgM. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / cut-off) ≥ 1,1 jsou reaktivní na anti-HAV IgM, < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 – 1,1 jsou reaktivní v šedé zóně (vyšetření opakovat v týdenních intervalech). Preciznost v sérii 2,6 – 6,7 %, mezi sériemi 6,2 – 13,0 %. Relativní senzitivita je 94,0 %, relativní specificita 99,4 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 5,6 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na dvoustupňové sekvenční imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči HAV ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin reagují s monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM imobilizovanou na polystyrénové kuličce; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se přidá HAV a polyklonální králičí protilátka vůči HAV konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-HAV IgM ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor. Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 až < 1,1 jsou neurčité, ≥ 1,1 jsou reaktivní.Preciznost v sérii je 4,4 – 12,0 %, celková 8,4 – 16,0 %. Relativní senzitivita je 97,3 %, relativní specificita 98,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvoustupňové reakci a sendvičovém uspořádání. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující anti-HAV IgM a paramagnetické částice potažené ovčí polyklonální protilátkou vůči lidskému IgM. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se konjugát HAV s myší monoklonální protilátkou vůči HAV značenou ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-HAV IgM. Měření se provádí při 470 nm. Analýza trvá 35 min; používají se dva kalibrátory (negativní a pozitivní). Cut-off se určuje v dubletu u negativního a v tripletu u pozitivního kalibrátoru. Vzorky s indexem cut-off < 1,0 jsou nereaktivní, ≥ 1,0 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 2,1 – 5,0 %, mezi sériemi 4,5 – 13,4 %. Relativní senzitivita je 99 %, relativní specificita 99,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 40,7 mmol/l a bilirubinu 136,8 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) se ředí diluentem a je inkubován ovčí protilátkou vůči lidskému Fdg (slouží k blokování IgG v přítomnosti anti-HAV značenému ruthéniovým komplexem). Pak se přidá s biotinylovaná monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgM, HAV, monoklonální myší anti-HAV značený ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm a je přímo úměrná množství anti-HAV IgM. Kvalitativní výsledky jsou stanoveny na základě dvoubodové kalibrace, kdy je automaticky vypočtená hodnota cut-off. Vzorky s indexem < 1,0 jsou nereaktivní, ≥ 1,0 jsou reaktivní na anti HAV IgM. Preciznost v sérii 1,3 – 4,6 %, mezi sériemi 2,5 – 7,9 %. Relativní senzitivita je 98,3 %, relativní specifičnost je 99,7 %. Hemolýza (hemoglobin 17,5 g/l), chylozita (triacylglyceroly 22,6 mmol/l), ikterus (bilirubin 855 µmol/l) a RF (< 3200 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Falešná negativita: snížení tvorby protilátek zvláště u dětí, fulminantní forma (anti-HAV IgM mají nedetekovatelné hladiny), pozdní stanovení (3 – 6 měsíců po infekci).

Falešná pozitivita: vysoké koncentrace revmatoidního faktoru, nespecifická aktivace tvorby IgM, pozitivita HAV IgM u vysoké koncentrace HAV-IgG, v souvislosti s jaterními enzymy.