Human immunodeficiency virus, virus lidské imunodeficience

Plná krev je stabilní při 2 – 8 °C 7 d, sérum 1 – 3 d při 25 °C, 2 – 8°C 3- 14 d, plazma s EDTA 2 – 8°C 8 d, sérum lze dlouhodobě skladovat při -20 °C.

Většina souprav stanovuje jak anti-HIV-1+2, tak antigen HIV-1 p24. Jsou označované jako combo  soupravy, menší počet souprav stanovuje pouze protilátky vůči HIV-1 a HIV2. Nejmenší počet souprav stanovuje antigen HIV-1 p 24 (někdy kvantitativně).

ELISA HIV-1 antigen p24. Imunokomplexy v séru nebo plazmě se rozloží chemicky při nízkém pH a za tepla. Vzorky jsou pak neutralizovány a pipetovány do jamek mikrotitračních destiček, které jsou potažené myší monoklonální protilátkou vůči HIV-1 p24. Imobilizovaná monoklonální protilátka zachytí jak volný HIV-1 p24, tak také antigen, který se uvolnil při rozpadu imunokomplexů. Vzorky tkáňových kultur nevyžadují výše uvedený rozklad a mohou se přidat přímo do jamek se zakotvenou monoklonální protilátkou. Navázaný antigen je dalším epitopem připojený na biotinylovanou polyklonální protilátku vůči HIV-1 p24 a následně na konjugát streptavidinu s křenovou peroxidázou. Vzniklý komplex je detekován reakcí s hydrochloridem o-fenylendiaminu, a žluté zbarvení produktu je přímo úměrné množství zachyceného HIV-1 p24. Z kalibrační křivky je určena hodnota absorbance cutoff. Vzorky, které mají absorbanci ≥ cutoff jsou reaktivní, ale nutno ještě stanovení opakovat, zda je reaktivita reprodukovatelná. Pak ještě následuje potvrzení pozitivity konfirmačním činidlem, které obsahuje specifickou protilátku k neutralizaci před samotným testem, jež indikuje přítomnost HIV-1 p24 antigenu.

ELISA anti-HIV-1+2. HIV specifické imunoglobuliny obsažené ve vyšetřovaném vzorku se navážou na rekombinantní proteiny HIV-1, HIV-2 a/nebo na HIV-1 (subtyp O), které jsou fixované na vnitřním povrchu jamky mikrotitrační destičky (30 min, 37 °C). Po promytí 4x se na tyto specifické protilátky váže konjugát HIV-Ag/POD (obsahuje rekombinantní a syntetické peptidy HIV); 30 min, 37 °C. Po promytí 4x se enzymová část konjugátu zbarví roztok tetrametylbenzidinu modře (30 min, laboratorní teplota, ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku 0,25 M H₂SO₄, který způsobí změnu na žlutou barvu. Intenzita žlutého zabarvení je úměrná koncentraci protilátek přítomných ve vzorku. Fotometrie se provádí do 1 h při 450/615-690 nm. Cutoff se určí jako průměrná absorbance negativní kontroly + 0,4. Negativní vzorky mají absorbanci < 0,9 cutoff, hraniční 0,9 – 1,0 cutoff, reaktivní na anti-HIV absorbance > cutoff. (V jiné soupravě se určuje cutoff jako průměrná absorbance negativní kontroly + 0,2; nereaktivní výsledky jsou < cutoff a reaktivní jsou ≥ cutoff).Relativní specifita je 99,3 %. Preciznost v sérii je 3,0 – 9,2 %, mezi sériemi 5,2 – 17,0 %. Lipemické, hemolytické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu.

ELISA HIV Combo. Imunoglobuliny specifické pro HIV v testovaném vzorku reagují s rekombinantními proteiny, resp. syntetickými peptidy HIV1, HIV2 a HIV1 (subtyp O) v jamkách mikrotitrační destičky. Současně se antigeny HIV-1 p24 obsažené ve vzorku mohou vázat na monoklonální protilátky vůči HIV p24 fixované na vnitřním povrchu jamky (30 min, 37 °C). Ve druhém kroku se odstraní nenavázané části vzorku (promytí 4x) a označí se specificky navázané protilátky přidáním směsi biotinem značených rekombinantních proteinů, resp. syntetických peptidů virů HIV-1, HIV-2 a/nebo HIV-1 (subtyp O). Současně jsou navázané virové antigeny označeny biotinem konjugovanou monoklonální protilátkou vůči HIV-1 p24 (30 min, 37 °C). Nenavázané konjugáty s biotinem jsou následně odstraněny (promytí 4x). Ve třetím kroku reaguje konjugát 2 (streptavidin/POD) s biotinovými konjugáty specificky navázanými na pevnou fázi (30 min, 37 °C). Po odstranění přebytečného konjugátu 2 (promytí 4x) se stanoví enzymová aktivita navázaného konjugátu (modrá barevná reakce). Enzymová přeměna (30 min, laboratorní teplota, ve tmě) chromogenu (tetrametylbenzidin) se přeruší přidáním zastavovacího roztoku 0,25 M H₂SO₄ (žlutá barevná reakce). Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci antigenu HIV-1 p24 a koncentraci protilátek HIV obsažených ve vzorku. Fotometrie se provádí do 1 h při 450/615-690 nm. Cutoff se určí jako průměrná absorbance pozitivní kontroly x 0,23. Negativní vzorky mají absorbanci < cutoff, reaktivní na anti-HIV a/nebo HIV-1 p24 absorbance ≥ cutoff. Analytická citlivost na HIV-1 p24 je < 30 ng/l. Relativní specifita je 99,89 %. Preciznost v sérii je 2,3 – 7,3 %, mezi sériemi 2,2 – 12,1 %. Lipemické, hemolytické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu.

Jiná souprava používá anti-HIV nebo HIV-1 p24 přímo vázané na křenovou peroxidázu. Tím se ušetří jeden reakční krok, ale analýza trvá stejně dlouho, protože imunoreakce trvá místo 2x30 min nyní 60 min. Cutoff se určuje jako průměrná absorbance negativní kontroly + 0,15; nereaktivní výsledky jsou < cutoff a reaktivní jsou ≥ cutoff.

Nepřímá fluorescence anti-HIV je mikroskopická metoda. Vzorky obsahující anti-HIV se vážou na antigeny připojené na pevnou fázi. V dalším kroku se protilátky vybarví fluoreskující značkou (fluorescein izotiokyanát FITC). Vzorky pro IgG protilátky jsou naředěny 100x a více. Imunofluorescence má < 5 % neurčitých výsledků, ale je dražší a složitější než western blot.

Imunoanalýza na mikročásticích anti-HIV-1+2 (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a latexové mikročástice potažené rekombinantními antigeny (obálkové HIV-1 a HIV-2 a jaderný HIV-1). Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a promyje. Do reakční matrice se přidají rekombinantní antigeny značené biotinem (HIV-1 env, HIV-1 core a HIV-2 env) a syntetické peptidy odpovídající HIV-1 env a HIV-2 env, čímž vznikne komplex antigen-protilátka-antigen. Po inkubaci a promytí se přidá konjugát králičích anti-biotinových protilátek s alkalickou fosfatázou, který se naváže na přítomný komplex antigen-protilátka-antigen v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je přímo úměrná anti-HIV. K jednobodové kalibraci (v tripletu) slouží indexový kalibrátor. Cut-off odpovídá průměrné reakční rychlosti indexového kalibrátoru + 27,5 (< cut-off mají negativní vzorky, naopak ≥ cut-off mají reaktivní vzorky). Preciznost v sérii je 3,0 – 5,7 %, mezi sériemi 3,7 – 6,9 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 99,9 %. Pacienti nedávno vystaveni kontaktu s EBV mohou mít falešně pozitivní výsledky na anti-HIV.

Imunoanalýza na mikročásticích Combo (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a latexové mikročástice potažené rekombinantními antigeny (obálkové HIV-1 a HIV-2 a jaderný HIV-1) a monoklonální myší protilátkou vůči HIV-1 p24. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a promyje. Do reakční matrice se přidají rekombinantní antigeny značené biotinem (HIV-1 env, HIV-1 core a HIV-2 env), syntetické peptidy odpovídající HIV-1 env a HIV-2 env a monoklonální biotinylované myší protilátky vůči HIV-1 p24, čímž vznikne komplex biotin-antigen-protilátka-antigen nebo biotinylovaná MAb-Ag-MAb. Po inkubaci a promytí se přidá konjugát králičích anti-biotinových protilátek s alkalickou fosfatázou, který se naváže na přítomný komplex biotin-antigen-protilátka-antigen nebo biotinylovaná MAb-Ag-MAb v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je přímo úměrná anti-HIV a HIV-1 p24. K jednobodové kalibraci (v tripletu) slouží indexový kalibrátor. Cut-off odpovídá průměrné reakční rychlosti indexového kalibrátoru + 27,5 (< 0,9 x cut-off mají negativní vzorky, 0,9 x cutoff až < cutoff neurčité a ≥ cut-off mají reaktivní vzorky). Preciznost v sérii je 3,7 – 7,2 %, mezi sériemi 5,9 – 9,3 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 99,8 %.

Chemiluminiscenční analýza Combo je dvoukrokový postup, kde se napřed smíchá vzorek s promývacím pufrem, ředícím roztokem a paramagnetickými mikročásticemi potaženými rekombinantním antigenem HIV-1/HIV-2 a myšími monoklonálními protilátkami vůči HIV-1 p24. Antigen HIV-1 p24 a protilátky anti-HIV-1/HIV-2 přítomné ve vzorku se naváží na mikročástice potažené antigeny HIV-1/HIV-2 a myšími monoklonálními protilátkami vůči HIV-1 p24. Po promytí se antigen HIV p24 a protilátky anti-HIV-1/HIV-2 naváží na konjugát s akridiniumkarboxamidem (rekombinantní antigeny HIV-1/HIV-2, syntetické peptidy a myší monoklonální protilátky vůči HIV-1 p24). Po dalším promývacím cyklu fosfátovým pufrem se do reakční směsi přidají 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HIV a HIV-1 p24 a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Jednobodová kalibrace (v tripletu) slouží k určení cutoff (průměrná hodnota kalibrátoru x 0,4). Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) < 1,00 jsou nereaktivní, ≥ 1,00 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 3,1 – 4,7 %, mezi sériemi 3,8 – 6,0 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 99,5 %. Silná hemolýza (> 5 g/l) ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou lze použít pro průkaz HIV-1+2. Vzorek se inkubuje v kyvetě 4 min při 37 °C a pak se přidají paramagnetické latexové částice potažené streptavidinem s biotinylovanými antigeny HIV a rekombinantní antigeny HIV značené esterem akridinu. Po inkubaci 17 min při 37 °C se nevázaná reagencie odsaje a zkumavky se promyjí fosfátovým pufrem a inkubují se 4 min při 37 °C. Ještě se přidají další rekombinantní antigeny HIV značené esterem akridinu a směs se inkubuje 18 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek fosfátovým pufrem se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství anti-HIV) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off se provádí dvoubodová kalibrace (v dubletu). Vzorky s koncentrací anti-HIV < cutoff se považují za nereaktivní a ≥ cutoff jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 2,2 – 7,7 %, mezi sériemi 3,9 – 10,2 %. Relativní senzitivita je 97,7 %, relativní specificita 99,7 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 513 µmol/l interferují < 10 %.

Combo postup Vzorek se inkubuje v kyvetě 4,7 min při 37 °C a pak se přidají paramagnetické latexové částice potažené streptavidinem s biotinylovanými rekombinantními antigeny HIV, peptidovým antigenem skupiny O a biotinylovanou protilátkou vůči HIV p24; dále se přidají rekombinantní antigeny HIV-1 a HIV-2 značené esterem akridinu a anti-HIV(p24) značené esterem akridinu spolu s peptidovým antigenem skupiny O. Po inkubaci 18 min při 37 °C se nevázaná reagencie odsaje a zkumavky se promyjí fosfátovým pufrem a inkubují se 4 min při 37 °C. Ještě se přidají další rekombinantní antigeny HIV-1 a HIV-2 značené esterem akridinu, anti-HIV (p24) značené esterem akridinu spolu s peptidovým antigenem skupiny O a směs se inkubuje 18 min při 37 °C. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek fosfátovým pufrem se inkubuje 4 min při 37 °C a pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství anti-HIV) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off (0,96 kU/l) se provádí dvoubodová kalibrace (v dubletu). Vzorky s koncentrací < cutoff se považují za nereaktivní a ≥ cutoff jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 2,5 – 3,8 %, mezi sériemi 6,3 – 8,8 %. Relativní senzitivita je 96,6 %, relativní specificita 99,2 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 11,3 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují < 10 %.

CLIA Combo s izoluminolem je další sendvičový zábleskový postup. Test využívá dvě kompletní činidla, jedno pro detekci protilátek vůči HIV a druhé pro detekci antigenu p24. Obě činidla musí být najednou přítomna ve stejném zařízení, které se používá pro testování vzorků. Po spuštění testu se vzorky testují s oběma činidly a poskytnou sloučené výsledky z obou činidel, ale na rozdíl od všech ostatních postupů se jedná vždy o dvě samostatné analýzy. Souhrnná relativní senzitivita je 93,1 %, relativní specificita 96,3 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Anti-HIV: Magnetické částice jsou potaženy rekombinantními antigeny HIV-1 (gp41), HIV-1 skupiny O a HIV-2 (gp35). Během první inkubace se anti-HIV, obsažené v kalibrátoru, vzorcích nebo kontrolách, naváží na pevnou fázi. Během druhé inkubace antigeny HIV-1 a HIV-2, označené izoluminolem, reagují s anti-HIV již navázanými na pevnou fázi. Nenavázaný materiál se po každé inkubaci odstraní promývacím cyklem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HIV. Kalibrátor stanovený v tripletu umožňuje určit cutoff. Vzorky s koncentrací < cutoff se považují za nereaktivní a ≥ cutoff jsou reaktivní na anti-HIV. Protilátky vůči HIV mohou být přítomny po účasti ve studii očkování proti HIV. Interpretace tohoto diagnostického výsledku závisí na typu podaného očkování. Preciznost v sérii 2,8 – 5,4 %, mezi sériemi 4,3 – 18,3 %.

HIV-1 p24: Během první inkubace se diferenciálně konjugované monoklonální protilátky vůči antigenu p24 HIV-1 (konjugované s biotinem anebo izoluminolem) smísí s kalibrátorem, vzorky nebo kontrolami. Při druhé inkubaci se přidají magnetické částice potažené streptavidinem. Nenavázaný materiál se po druhé inkubaci odstraní promývacím cyklem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině antigenu p24 HIV-1. Kalibrátor stanovený v tripletu umožňuje určit cutoff. Vzorky s koncentrací < cutoff se považují za nereaktivní a ≥ cutoff jsou reaktivní na HIV p24. Vzorky pacientů, kteří užívají léčebné dávky vitamínu H (biotin), mohou interferovat u testů založených na biotinylovaných reagenciích a zvyšují falešně negativní výsledky během akutní infekce HIV. Takové výsledky je proto nutné interpretovat opatrně. Analytická citlivost na HIV-1 p 24 je 1,26 kU/l. Preciznost v sérii 3,0 – 9,5 %, mezi sériemi 2,5 – 13,3 %.

Další Combo postup používá luminogen Lumi-Phos 530 v sekvenční dvoustupňové reakci. Do zkumavky se pipetují standard nebo vzorek, paramagnetické částice potažené rekombinantními polypeptidy HIV-1 pg160, HIV-1-O gp41 a HIV-2 gp36, jakož i monoklonální protilátkou vůči antigenu HIV-1 p24. Přidá se biotinylovaná monoklonální protilátka vůči antigenu HIV-1 p24 (vše v pufru TRIS). Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Ve druhé kroku se přidají polypeptidy (HIV-1, HIV-1-O, HIV-2) vázané na ALP spolu se streptavidinem konjugovaným s ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-HIV-1+2 a HIV p24. Doba analýzy je 60 min. Na základě dvou kalibrátorů se vypočte cutoff. Vzorky s koncentrací < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní. Preciznost v sérii 2,6 – 10,6 %, mezi sériemi 4,6 – 10,1 %. Analytická citlivost na HIV-1 p24 je < 2 kU/l. Relativní senzitivita je pro anti-HIV-1 99,4 %, pro anti-HIV-2 97,1 %, pro HIV p24 96,5 %; relativní specificita celkem 94,9 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (2 g/l), bilirubinu (513 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Chemiluminiscenční analýza anti-HIV-1+2 je dvoustupňová, kdy se v prvním kroku anti-HIV ze vzorku váže na rekombinantní HIV antigeny z kvasnic (Env 13, Env AL, Env 10, p24), kterými jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidají se rekombinantní HIV značené křenovou peroxidázou. Po inkubaci se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. První výsledek je k dispozici za 41 min (souhrnný čas inkubací při 37 °C je 29 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný koncentraci ani-HIV ve vzorku. Pomocí kalibrátoru a korekčního faktoru se upraví vzorová kalibrační křivka a vypočte cutoff. Analytická citlivost je < 0,1 kU/l PEI. Vzorky s koncentrací anti-HIV < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na anti-HIV. Preciznost v sérii 1,0 – 5,8 %, mezi sériemi je 2,4 – 12 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specifita 99,9 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (33,9 mmol/l) neruší při analýze. Nelze použít zakalené vzorky. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza HIV-1 antigenu p24 v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči HIV-1 p24. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči HIV-1 p24 a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-HIV-1 p24-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci HIV-1 p24 ve vzorku. Rozsah metody je 0,5 – 3000 µg/l. Detekční limit je 0,525 µg/l. Souprava umožňuje kvantitativní stanovení HIV-1 p24.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) p24 antigenu HIV v sekvenčním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s biotinylovanou myší monoklonální protilátkou vůči HIV p24 a monoklonální protilátkou vůči HIV p24 značenou ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině HIV p24 ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace dovolující výpočet cutoff. Vzorky s koncentrací HIV p24 < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na antigen p24 HIV. Detekční limit je 0,5 kU/l. Preciznost v sérii 0,9 – 7,6 %, mezi sériemi 2,6 – 11,7 %. Relativní specificita je 99,8 %. Hemolýza (hemoglobin 20 g/l), chylozita (triacylglyceroly 16,9 mmol/l), ikterus (bilirubin 428 µmol/l) a RF (< 2400 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

ECLIA p24 HIV konfirmační test je založen na principu neutralizace specifické protilátky. Polyklonální protilátky specifické vůči HIV se váží na imunodominantní epitopy antigenu HIV p24 a blokují tím vazebná místa pro protilátky, používané ve stanovení antigenu HIV. Přebytek protilátek vůči HIV v konfirmační reagencii neutralizuje veškerý HIV Ag ve vzorku. Při následném stanovení p24 HIV to vede ke snížení hodnoty indexu cut-off (signál vzorku/cut-off) ve srovnání s hodnotou, která byla u vzorku zjištěna s paralelně změřenou kontrolní reagencií. Inkubace se provádí 30 – 120 min při 15 – 25 °C. K potvrzení pozitivního výsledku vzorku musí být neutralizace vzorku v konfirmační reakci > 50 % z hodnoty kontrolní reakce se vzorkem.

ECLIA Combo je trojstupňový postup, který trvá 27 min. Vzorek (40 µl) je inkubován s detergentem v pufru MES, tj. 2-N(morfolino)etansulfonovou kyselinou. V další inkubaci dochází k reakci s biotinylovanou myší monoklonální protilátkou vůči HIV p24, monoklonální protilátkou vůči HIV p24 značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanými rekombinantními antigeny, biotinylovanými specifickými peptidy, rekombinantními antigeny značenými ruthéniovým komplexem a specifickými peptidy značenými ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině HIV p24 a anti-HIV-1+2 ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace dovolující výpočet cutoff. Vzorky s koncentrací HIV p24 a/nebo anti-HIV-1+2 < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,0 cutoff jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na antigen p24 HIV a/nebo anti-HIV-1+2. Detekční limit Ag je ≤ 2 kU/l. Preciznost v sérii 0,9 – 2,5 %, mezi sériemi 1,5 – 4,0 %. Relativní senzitivita je 99,7 %, relativní specificita je 97,8 %. Hemolýza (hemoglobin 5 g/l), chylozita (triacylglyceroly 16,9 mmol/l), ikterus (bilirubin 1026 µmol/l) a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Western blot anti-HIV postup začíná elektroforetickou separací HIV bílkovin, které jsou překryty sérem pacienta. Jsou li přítomné protilátky, tak se vážou na antigen a navázané protilátky jsou vizualizovány značenou protilátkou vůči lidskému IgG. Pozitivita je prokázána, jsou-li vidět alespoň dva ze tří pásů: p24, gp24 a gp160/120. Přítomnost jiných pásů není rozhodující. Western blot je složitý postup, vyžadující velkou zkušenost. Falešná pozitivita dosahuje 1 – 2 %. Nevýhodou je značný počet neurčitých výsledků a až 40 % reaktivních vzorků je při opakování neurčitých.

Mezinárodní standard: (WHO International Standard) 3rd HIV-1 International Standard NIBSC code: 10/152, Version 4.0, 01/08/2012.

Falešná negativita: imunologické okno, imunodeficitní stavy.

Falešná pozitivita: autoimunitní stavy, při zvýšené koncentraci imunokomplexů, po vakcinaci proti chřipce.