Antigen skvamozních buněk; squamous cell carcinoma antigen

Stanovení se provádí v séru, jinde se uvádí i plazma (antikoagulans heparin nebo EDTA). Je třeba vyloučit kontaminaci z pokožky a hemolýzu. Sérum je stabilní 7 d při 15 – 25 °C, 1 – 30 d při 4 – 8 °C, 1 – 3 měsíce při -20 °C.

IRMA souprava byla na sendvičovém principu, ale již není komerčně dostupná.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce potažené streptavidinem. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje se s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči SCCA a monoklonální protilátkou vůči SCCA s navázanou křenovou peroxidázou. Po inkubaci (1 h) a promytí 6x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 30 min se měří při 620 nm, nebo je zastavena stop činidlem (0,12 M HCl) a absorbance se měří do 15 min při 405 nm. Celý postup je při laboratorní teplotě. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší koncentrace triacylglycerolů 11,3 mmol/l, bilirubinu 1026 µmol/l ani hemoglobinu 5 g/l. Rozsah měření na základě pětibodové kalibrace je 0,3 – 50 µg/l (vyšší koncentrace, zejména amniová tekutina se ředí 51x). Detekční limit je 0,3 µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 50000 µg/l. Preciznost v sérii je 1,9 – 2,4 %, mezi sériemi 1,1 – 1,9 %. Linearita ředění 90 – 110 %, zpětný výtěžek 90 – 110 %. Při reakci interferují heterofilní protilátky a podávané myší monoklonální protilátky.

Další ELISA má zakotvené králičí protilátky vůči SCCA v jamkách. Pipetují se kalibrátory a vzorky. Po inkubaci (1 h) a promytí (3x) se přidá králičí biotinylovaná protilátka vůči SCCA. Reakční směs se inkubuje 1 h a po promytí (3x) se přidá konjugát streptavidinu s POD a opět se inkubuje (1 h). Po promytí (3x) se přidá tetrametylbenzidin, nechá se proběhnout barevná reakce (10 – 15 min ve tmě) a měří se při 650 nm, nebo se přidá stop činidlo (1 M HCl) a měří se absorbance při 450±20 nm do 60 min, která je přímo úměrná množství SCCA. Celý postup je při laboratorní teplotě. Rozsah pětibodové kalibrace je pouze 0,5 – 8 µg/l SCCA a analytický postup je podstatně delší, než u předchozí metody.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Inkubace trvá 44 min. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k SCCA) přímo úměrný hladině SCCA. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,1 – 100 µg/l (po automatickém ředění až do 500 µg/l). Analytická citlivost je 0,1 µg/l, funkční citlivost 0,34 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 500 µg/l. Preciznost v sérii 0,6 – 2,3 %, mezi sériemi 3,7 – 5,2 %. Hemoglobin do 4,5 g/l, bilirubin do 684 µmol/l, lipémie do 11,3 mmol/l, RF do 1000 kU/l neruší. Linearita ředění je 95 – 116 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) již není komerčně dostupná.

Chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá myší monoklonální protilátku vůči SCCA, zakotvenou na paramagnetických částicích ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči SCCA značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci SCCA a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky v rozmezí koncentrací 0,1 – 70 µg/l (vyšší koncentrace se ředí manuálně 10x, nulovým kalibrátorem). Preciznost v sérii 3,3 – 5,0 %, celkově 4,0 – 5,9 %. Zpětný výtěžek je 91,3 – 104,4 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového blanku) je 0,1 µg/l. Při koncentraci 150 µg/l nebyl zaznamenán detekovatelný přenos. Ani koncentrace hemoglobinu 5 g/l, bilirubinu 342 µkat/l a triacylglycerolů 33,9 mmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Poločas vymizení 20 min.

Toleranční limit EHK: 23 %.

Hodnoty snižuje: přítomnost heterofilních protilátek (někdy).

Hodnoty zvyšuje: těhotenství, kontaminace s pokožkou (pot, sliny), kontaminace tělesnými tekutinami, hemoglobin > 0,8 g/l, hemodialýza, přítomnost heterofilních protilátek (někdy), použití polyklonálních antisér.