5-HIAA, 5-hydroxyindoleacetic acid, 5-hydroxyindole-3-acetic acid

Moč sbíráme kvantitativně 24 h do plastové nádoby, kterou uchováváme v chladničce (pokud sbíráme při pokojové teplotě, je třeba předem přidat do sběrné nádoby 20 ml 6 M HCl). 3 – 4 d před sběrem a během sběru nutno dodržovat dietu s vyloučením alkoholu, banánů, kiwi, rajčat, avokáda, vlašských ořechů, rozinek, ořechů, švestek, ananasu, melounu. Jednorázový vzorek je pouze orientační, lepší je ho přepočítat na močový kreatinin. 5-HIAA je nestabilní při alkalickém pH. Při úpravě pH na 3 – 4 (6 M HCl nebo H₃BO₃) je stabilita 5-HIAA 2 h – 7 d při 15 – 25 °C, 2 d až > 1 měsíc při 4 °C nebo -20 °C.

Fotometrie se původně používala k detekci reakce 5-HIAA s dimetylaminobenzaldehydem. V současné době se detekuje purpurové zbarvení reakce s 1-nitroso-2-naftolem, které vzniká při reakci s dusitanem sodným v prostředí 1 M H₂SO₄. Vytřepání s etylendichloridem slouží k odstranění interferentů; v případě pozitivního výsledku je purpurově zbarvena horní vodná vrstva (kvalitativní průkaz).

Kvantitativní postup začíná extrakcí 5-HIAA, dalších fenolických kyselin a lékových metabolitů z okyselené moče (nepoužívat CH₃COOH!) do dietyléteru. Pro podporu kvantitativní extrakce se přidá saturující množství NaCl. 5-HIAA se pak zpětně extrahuje do fosfátového pufru a reaguje s 1-nitroso-2-naftolem a kyselinou dusitou (NaNO₂ + H₂SO₄) 5 min při 37 °C za vzniku fialového zbarvení (535 nm). Po přidání merkaptoetanolu při 37 °C vzniká (20 min) modrý chromofor (maximum 645 nm), ale měření se obvykle provádí (ihned) při 590 nm (lineární závislost). Základní tříbodová kalibrace je do 78 µmol/l 5-HIAA.

RIA využívá konjugát ¹²⁵I-glycyltyrosinu s 5-HIAA a králičího antiséra získaného imunizací konjugátem 5-HIAA s lidským albuminem a 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidem. Kompetitivní postup má mez detekce 0,1 ng na zkumavku.

FPIA vyžaduje extrahovanou moč. Okyselená moč 6 M HCl se extrahuje do organického rozpouštědla (dichloretan- terciární amylalkohol 2+1) a pak po protřepání a centrifugaci se odpipetuje spodní vrstva a extrahuje ještě kyselým extrakčním činidlem (vodný roztok 0,01 mol/l H₃PO₄). Po protřepání a centrifugaci se odpipetuje horní vrstva pro analýzu. Fluorescein jako marker se používá při homogenní fluorescenční polarizační imunoanalýze. Vzorek se pipetuje spolu s fosfátovým pufrem a antisérem vůči 5-HIAA. Po změření blanku se přidá 5-HIAA značená fluoresceinem. Po inkubaci se měří fluorescence (excitace 490 nm, emise 517 nm), která je nepřímo úměrná množství 5-HIAA. Rozsah kalibrace na základě šesti kalibrátorů 1 – 104 µmol/l (vyšší koncentrace 5-HIAA lze ředit manuálně 10x). Analytická citlivost 1 µmol/l. Analýza trvá 20 min. Preciznost v sérii 2,19 – 3,50 %, mezi sériemi 3,43 – 5,33 %; zpětný výtěžek 97,4 – 97,8 %. Křížová reakce: indoloctová kyselina 5,8 – 7,2 %, ostatní < 1,0 %. 

GC-MS  začíná extrakcí vzorku do acetonitrilu. Suspenze je centrifugována a acetonitril odpařen. Do vodného podílu je přidán NaCl a suspenze extrahována éterem. Organický extrakt je derivatizován N-metyl-N (trimetylsilyl)trifluoracetamidem. GC provedena se silylovanou 5-HIAA a jejím derivátem coby vnitřním standardem. Detekční limit byl 0,001 µmol/l, rozsah měření do 0,005 – 52 µmol/l. Preciznost v sérii 2,3 – 10 %, mezi sériemi 4,3 – 5,3 %; zpětný výtěžek 80 – 98 %.

HPLC používá k analýze moč bez konzervace. Moč se pipetuje do acetátového pufru. Mobilní vodná fáze je nastavena na pH 5,1 a pak přidán metanol a acetonitril (150+2+2). Kolona reverzní fáze C₁₈ 250x4,6 mm. K detekci se používá elektrochemický detektor (500 mV, citlivost 100 mA/V, průtok 1 ml/min). Jako vnitřní standard se používá 5-hydroxyindol-3-karboxylová kyselina. Kalibrace je do 260 µmol/l (vyšší koncentrace 5-HIAA nutno ředit vodou).

HPLC-MS/MS používá jako vnitřní standard 5-HIAA-²H₂. Vzorek se rozpustí ve směsi acetonitril-voda 1+4. Stacionární fáze je oxid křemičitý potažený C₁₈ v koloně 100x2,1 mm. Mobilní fáze používá gradient od 0,1 % vodného roztoku kyseliny mravenčí po 100 % acetonitril s cyklem 3,6 min. Hmotnostní spektrometr s elektrosprejí s negativní ionizací, s dusíkem jako rozprašovacím a desolvatačním plynem a argonem jako kolizním plynem (teplota zdroje 140 °C, desolvatační plyn 400 °C, napětí v kapiláře 2,7 kV, v násobiči 650 V). Sledovány molekulární ion m/z 190 a 192 (vnitřní standard) a produkty 146,2 a 116,2 resp. 148,2 (vnitřní standard). Rozsah měření 2 – 65 µmol/l. Preciznost v sérii 1,5 – 3,3 % %, mezi sériemi 1,0 – 2,9 %; zpětný výtěžek 93,1 – 102,9 %.

Hodnoty snižuje: nikotin, požití alkoholu, alkalická a neutrální moč, formaldehyd, věk > 60 let, ženy < muži, deprese, stres, fenylketonurie; léky: aspirin, hydralazin, chlorpromazin, izokarboxazid, ketokyseliny, kortikotropin, kyselina gentisová, kyselina dihydroxyfenyloctová, levodopa, metenamin, metyldopa, perchlorperazin, promazin, prometazin, ranitidin, streptozocin, tricyklická antidepresiva.

Hodnoty zvyšuje: potraviny s obsahem hydroxyindolu nebo tryptofanu, těhotenství, kouření, spánková deprivace, migréna, fototerapie, karcinomy (prs, žaludek, štítná žláza), malabsorpce, chronická střevní obstrukce; léky: acetamid, acetaminofen, acetanilid, atenolol,  β-blokátory, diazepam, efedrin, epinefrin, fenobarbital, fentolamin, fenacetin, fluorouracil, guajakolát, indometacin, jodidy, kofein, kumariny, kyselina acetoctová, deriváty kyseliny acetylsalicylové, melfalan, metokarbamol, metamfetamin, mefenesin, nabumeton, deriváty naftalenu, nikotin, paracetamol, pindolol, reserpin, robaxin, diazepam.