vWF, VWF,  protikrvácivý faktor, ristocetinový kofaktor, RiCo, VWF:FVIII, VWF:CB, VWF:RCo 

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla déle než 1 min. Transport materiálu do laboratoře do 2 h. Stabilita plazmy je 4 h při 15 až 25 °C. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

V případě zamrazení plazmy volíme dvojitou centrifugaci a oddělujeme plazmu 0,5 – 1,0 cm nad suspenzí erytrocytů. Plazmu lze ji skladovat 4 týdny při teplotě -20 °C nebo 6 měsíců při teplotě -70°C . Pro následné zpracování zamrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu cca 5 min ve vodní lázni o teplotě 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.

VWF patří mezi největší molekuly v plazmě, tvoří tzv. multimery. Má několik funkcí, z kterých nejdůležitější je vazba na neaktivní faktor VIII (jeho ochrana) a funkce adhezivní molekuly, která se podílí na vytváření primární zátky a lokalizuje FVIII v místě tvorby sraženiny.

V praxi existuje několik imunologických metod, které měří antigen VWF a to jak jeho celkové množství (kvantitu), tak i zastoupení jednotlivých multimerů nebo kvalitativní deficit v schopnosti vázat se na jiné molekuly.

Kvantitativní testy:

Latexový test – latexové mikročástice, potažené protilátkou proti lidskému VWF, jsou inkubovány s ředěným vzorkem. V přítomnosti VWF dochází k aglutinaci částic, síla aglutinace je měřena imunoturbidimetricky. Rozsah měření se pohybuje v rozsahu 10 – 105 %. V případě, že je hladina VWFAg < 10 %, použije se k vyšetření neředěná plazma, je-li hladina antigenu > 105 %, je nutné provést vyšetření při vyšším ředění plazmy. Detekční hladina je 2 % antigenu VWF

Metoda ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay – analýza na bázi enzymové fluorescence) kombinuje dvoukrokovou sendvičovou metodu imunoanalýzy s konečnou detekcí pomocí fluorescence. Na pevné fázi je zakotvená protilátka vůči lidskému VWF; po nanesení ředěného vzorku dojde k vyvázání VWF a nenavázané složky se eliminují během promývací fáze. Poté se přidá konjugát, který se naváže na antigen zachycený během prvního kroku. Nenavázané složky se eliminují během promývací fáze. V konečném detekčním kroku se přidá substrát (4-metylumbeliferylfosfát). Konjugovaný enzym katalyzuje hydrolýzu tohoto substrátu na fluorescenční produkt (4-metylumbeliferon), jehož fluorescence se měří při 450 nm. Intenzita fluorescence je úměrná koncentraci antigenů přítomných ve vzorku. Rozsah měření: 1 – 120 % (vzorky s koncentraci VWF > 120 % se musí ředit diluentem), mez detekce ≤1%

 V ELISA provedení je protilátka imobilizovaná na mikrotitrační destičce. Po navázání VWF ze vzorku a promytí se použije další protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou. Detekce se provádí pomocí tetrametylbenzidinu, který v přítomnosti peroxidu vodíku poskytuje modré zbarvení. Detekce se provádí při 450 nm. V některých ELISA provedeních je ještě začleněna vazba biotin-streptavidin (druhá protilátka je biotinylovaná a v dalším kroku se použije konjugát streptavidin-peroxidáza), čímž se zesílí detekovaný signál. Množství VWF antigenu se odečte z kalibrační křivky.  Meřící rozsah je 2.5 mU/ml - 80 mU/ml, analytická citlivost je 2.5 mU/ml, výtěžnost metody je 87 - 118 %, precíznost v sérii je 5,0 %, mezi sériemi je 7,1 %

Kvalitativní testy odhalují funkční poruchu VWF:

Stanovení schopnosti vázat se na  faktor VIII (VWF:FVIII) – v ELISA provedení je na pevné fázi ukotvená protilátka vůči VWF. Po inkubaci se VWF ze vzorku naváže na protilátku. Jelikož VWF tvoří komplex s FVIII, v dalším kroku se po promytí pevná fáze inkubuje s roztokem chloridu vápenatého, který uvolní faktor VIII z komplexu. Po promytí následuje inkubace s rekombinantním faktorem VIII. V dalším kroku se použije rekombinantní králičí protilátka vůči VWF, která je konjugovaná s peroxidázou, nebo rekombinantní ovčí protilátka vůči faktoru VIII, rovněž konjugovaná s peroxidázou. Po konečném promytí se detekce provádí pomocí tetrametylbenzidinu. Test je postavený tak, aby bylo možné detekovat množství navázaného VWF ze vzorku a množství rekombinantního faktoru VIII, který se na VWF navázal. Hodnoty jsou vyjádřeny v procentech ve srovnání s normální plazmou.

Stanovení schopnosti vázat se na kolagen (VWF:CB) – metoda poprvé popsaná v roce 1986. V ELISA provedení je na pevné fázi ukotvený kolagen typu III nebo kolagen typu I, izolovaný z lidské placenty. Po inkubaci se VWF se vzorku naváže na kolagen. V dalším kroku se po promytí použije protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou. Po opětném promytí se detekce provádí pomocí tetrametylbenzidinu. Kolagen typu III je citlivý na deficit vysokomolekulárních multimerů VWF. Tento test je lépe standardizovatelný než ristocetinový kofaktor.

Stanovení ristocetinového kofaktoru (VWF:RCo) – metoda poprvé popsaná v 70-tých letech.  Stanovuje schopnost komplexu von Willebrandova faktoru s faktorem VIII agregovat krevní destičky v přítomnosti antibiotika ristocetinu, což vyjadřuje jeho schopnost vázat se na destičkový GPIb. Test využívá komerční stabilizovanou suspenzi destiček s ristocetinem, ke které se přidává vyšetřovaný vzorek v různém ředění. Provedení testu může být:

semikvantitativní – odečtením titru, při kterém ještě dochází k agregaci destiček. Odečtený titr se vynásobí s hodnotou citlivosti reagencie a výsledek se uvádí v procentech.

kvantitativní – k ředěnému vyšetřovanému vzorku se přidá stabilní suspenze krevních destiček a ristocetinu a sleduje se agregace. Detekce agregace může být optická (nefelometrie) nebo impedanční. Výsledky se odečítají z kalibrační křivky.

Stanovení schopnosti vázat se na glykoprotein Ib – jedná se o imunologickou variantu ristocetinového kofaktoru. V ELISA testu jsou mikrotitrační jamky potažené rekombinantními fragmenty glykoproteinu Ib. Po inkubaci se vzorkem a následném promytí se použije protilátka vůči VWF, značená křenovou peroxidázou. Navázaná protilátka se kvantifikuje fotometrickou reakcí s o-fenylendiaminem při 492 nm. Absorbance je přímo úměrná koncentraci VWF. Kalibrační křivka je konstruovaná pomocí sériových ředění standardní plazmy.

Průtoková cytometrie – je metoda, při které je inkubovan vzorek plazmy spolu s ristocetinem a fluorochromem značenými stabilizovanými destičkami. Používá se směs destiček, část značená jedním fluorochromem a část druhým (zelený a červený). Princip spočívá v tom, že každý multimer VWF má více vazebných míst pro GPIb destiček. Multimery s vyšší molekulovou hmotností vytváří mikroagregáty. Rozsah dvojité pozitivity mikroagregátů (červená a zelená), koreluje s plazmatickou VWF:RCo aktivitou. Rozsah tvorby mikroagregátů je ovlivněna zastoupením multimerů o vyšší hmotnosti. Multimery o nízké molekulové hmotností nejsou schopny vytvářet agregáty s více destičkami.

Metody VWF:RCo mají poměrně horší preciznost a vyšší odchylky v mezilaboratorním porovnání než ostatní funkční metody, ale patří mezi nejčastěji používané testy VWF.

Test s botrocetrinen (hadí jed Bothrops Jararaca) je podobný ristocetinovému testu. Botrocetrin mění konformaci VWF, a tím zvyšuje jeho afinitu k GPIb, ale u některých pacientů byl hlášen výsledek 100 %, přičemž s ristocetinem byl 0 %.

Na trhu existují i imunologické testy, které měří funkční aktivitu von Willebrandova faktoru (VWF:Act) pomocí různých monoklonálních protilátek. Imunoturbidimetrická metoda má na latexových částicích ukotvenou monoklonální protilátku, která je zaměřená proti funkčnímu místu VWF, jež se váže na destičkový glykoprotein Ib (GPIb). Tento test je nezávislý na ristocetinu. Studie z roku 2012 prokázala, že nejvhodnější metody pro detekci deficitu vysokomolekulárních multimerů je VWF:CB a VWF:RCo. Metoda VWF:Act je citlivá i k poklesu nízkomolekulárních multimerů (klinicky nevýznamné).

Speciálním vyšetřením je analýza multimerů VWF. Používá se dvojrozměrná imunoelektroforéza (2D-CIE) s použitím neredukujícího agarózového gelu v přítomnosti dodecylsulfátu (SDS). Gely mohou mít různé koncentrace, např. > 1,5 % pro vyšší rozlišení, a < 1 % pro nižší rozlišení. Pro diagnostické účely se používá většinou gel s nízkým rozlišením, jelikož jsou zajímavé multimery o vyšší molekulární hmotnosti.

Intraindividuální CV je 2,5%

Zvýšení hodnot: akutní fáze zánětu, stres, těhotenství, hormonální antikoncepce, luteální fáze cyklu, fyzická zátěž, starší lidé s rozvojem aterosklerózy, vzestup s věkem.

Snížení hodnot: trombocytémie (pseudo von Willebrandova nemoc), špatný odběr (aktivace koagulace a krevních destiček), krevní skupina 0, dysproteinémie, kyselina valproová a jiná antikonvulziva, po velkých dávkách hydroxyetyl-škrobu.