procalcitonin, calcitonin precursor, calcitonin preproprotein, calcitonin(?),

PROCL, CALCA, CALC1, CGRP, CGRP-I, CGRP1, CT(?), KC(?)

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA, citronan nebo heparin). Stabilita v séru 4 h při 15 – 25 °C (za 24 h se odbourá 10 % prokalcitoninu), 4 týdny při -20 °C, dlouhodobě při -80 °C.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou protilátkou vůči prokalcitoninu. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje se 2,5 h (třepání). Po inkubaci a promytí 4x se přidá biotinylovaná protilátka vůči prokalcitoninu a inkubuje se 1 h (třepání). Po inkubaci a promytí 4x se přidá streptavidin s navázanou křenovou peroxidázou a inkubuje se 45 min (třepání). Po inkubaci a promytí 4x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 30 min (v některých soupravách jen 10 min) ve tmě (třepání) je zastavena stop činidlem (0,2 M H₂SO₄). Měření se provádí ihned (nebo do 15 min) při 450 nm. Rozsah měření na základě osmibodové kalibrace je 0,03 – 20 (0,012 – 3,2) µg/l. Detekční limit je 0,03 (0,012) µg/l. Preciznost v sérii je < 10 %, mezi sériemi < 12 %. Linearita ředění 97 – 124 %, zpětný výtěžek (sérum) 70 – 91 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 19 min mezi prokalcitoninem ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči prokalcitoninu značenou Eu³⁺ a monoklonální protilátkou vůči prokalcitoninu, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k prokalcitoninu) přímo úměrný hladině prokalcitoninu. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,02 – 50 µg/l, po automatickém ředění až do 5000 µg/l. Analytická citlivost 0,02 µg/l; funkční citlivost 0,06 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 5000 µg/l. Linearita ředění 80 – 120 %. Preciznost v sérii 5 – 15 %, mezi sériemi 6 – 15 %. Hemolýza, chylozita a ikterus stanovení neruší.

Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní (sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. Prokalcitonin se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku vůči prokalcitoninu značenou fluoresceinem. Inkubace probíhá 5,75 min při 37 °C. Následně se přidávají paramagnetické částice niklu potažené monoklonální myší protilátkou vůči fluoresceinu a monoklonální myší protilátka vůči prokalcitoninu značená esterem akridinu. Reakce probíhá 18 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci prokalcitoninu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická. Linearita metody je do 75 µg/l. Vzorky s koncentrací prokalcitoninu vyšší než 75 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Používané automatické ředění je 1:20. Naměřený výsledek přístroj násobí 20x. Analytická citlivost metody je 0,03 µg/l, funkční citlivost 0,06 µg/l. Preciznost v sérii 1,5 – 4,3 %, mezi sériemi 2,1 – 8,5 %. Efekt nadbytku antigenu se při 2000 µg/l projevuje jako snížení výsledku o 75 µg/l. Při metodě neruší: hemoglobin do koncentrace 5 g/l, triacylglyceroly do koncentrace 11,3 mmol/l, bilirubin do koncentrace 684µmol/l. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během první inkubace (10 min) prokalcitoninu a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) druhá monoklonální myší protilátka značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině prokalcitoninu. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,1 – 500 µg/l. Analytická citlivost je 0,032 µg/l, funkční senzitivita 0,24 µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 800 µg/l. Preciznost v sérii 2,0 – 3,8 %, mezi sériemi 3,2 – 9,5 %. Linearita ředění je 97,7 – 107,1 %, zpětný výtěžek 103 – 106 %. Koncentrace hemoglobinu < 1 g/l, bilirubinu < 214 µg/l a triacylglycerolů < 14,1 mmol/l neruší. Extrémně vysoké koncentrace HAMA mohou ovlivnit výsledky.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (30 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči prokalcitoninu a monoklonální myší protilátkou vůči prokalcitoninu značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci prokalcitoninu ve vzorku. Chylozita, hemolýza, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,02 – 100 µg/l (ředění 5x manuálně umožňuje měření do 500 µg/l – koncentrace ředěného vzorku musí být > 1 µg/l). Analytická citlivost je 0,02 µg/l, funkční citlivost 0,06 µg/l. Preciznost v sérii CV 0,9 – 8,8 %, mezi sériemi 1,6 – 16,3 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1000 µg/l. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek proti streptavidinu nebo rutheniu.

Zvýšené hodnoty jsou u novorozenců (do 5 dnů klesají k normě).