Anti-CMV Antibodies-IgM; Cytomegalovirus antibodies – IgM; CMV Antibodies, IgM; CMV IgM.

Stanovení se provádí v séru, není-li jiná možnost tak plazmě (antikoagulans EDTA, heparin nebo citrát). Následný vzorek do 1 měsíce. Stabilita v séru při laboratorní teplotě 1 d, při 4 – 8 °C 7 – 14 d, při -20°C 1 rok. Opakované rozmrazení se nedoporučuje.

Latexový test na principu pasivní aglutinace je kvalitativní (bez ředění), resp. kvantitativní (při sledování ředění dvojkové řady) test na proužku k průkazu CMV IgG + CMV IgM. Latexové částice potažené CMV antigeny AD169 aglutinují v přítomnosti protilátek vůči CMV. Výsledek se odečítá za 8 min pod lampou. Relativní senzitivita je 99 %, relativní specificita 97 %.

Komplement fixační test je reakce CMV antigenu soupravy s protilátkou ze vzorku, která je prokazována fixací (spotřebou) komplementu. Indikací fixace je hemolýza. Hemolytický systém tvoří ovčí erytrocyty a protilátky vůči ovčím erytrocytům (amboreceptory). Jestliže neprobíhá reakce mezi antigenem a protilátkou, protože se CMV protilátky v séru pacienta nenacházejí, komplement se nespotřebuje a je dostupný pro indikační reakci. Reakce antigenu s protilátkou indikačního systému vede k lýze ovčích erytrocytů (hemolýze) působením komplementu. Imunoreakce probíhá v mikrotitračních destičkách při 2 – 8 °C 15 – 24 h. Pak se přidá hemolytický systém a inkubuje se 15 – 30 min při 37 °C. Výsledky se odečítají vizuálně. Tento semikvantitativní postup nerozlišuje mezi CMV IgG a CMV IgM.

IRMA využívala polystyrénové kuličky potažené CMV. Po reakci s CMV IgM se připojila protilátka vůči lidskému IgM značená ¹²⁵I. Po inkubaci se supernatant odsál a zkumavky se 3x promyly. Navázaná aktivita se změřila gama-počítačem (1 min). Souprava už není na trhu.

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotveným CMV. Aby se předešlo falešně pozitivním výsledkům z důvodu případného vlivu RF, provádí se úprava vzorku pomocí absorbentu RF. Ten na sebe váže IgG protilátky obsažené v testovaném vzorku. Veškerý RF obsažený ve vzorku se naváže na výsledné imunokomplexy a je tak eliminován. RF absorbent na sebe naváže až 15 mg IgG/ml (vztaženo na neředěný vzorek) a odstraňuje také veškeré IgG specifické pro daný virus. Tento vedlejší efekt zvyšuje senzitivitu pro stanovení IgM. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (60 min, 37 °C) se roztok odsaje a jamky 4x promyjí. Pak se přidá kozí protilátka vůči lidskému IgM označený křenovou peroxidázou. Imunoreakce se provádí se 60 min při 37 °C, roztok se odsaje a jamky 4x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 30 min ve tmě při 18 – 25 °C) a následně stop činidlo. Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem < 0,1 jsou negativní, ≥ 0,1 až ≤ 0,2 hraniční, > 0,200 jsou pozitivní. Preciznost v sérii 6,7 – 21,6 %, mezi sériemi 4,8 – 25,3 %. Relativní senzitivita je 95 %, relativní specificita 100 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší.

K dispozici je také ELISA souprava pro IgG+IgM CMV. Používá mikrotitrační destičky se zakotveným CMV. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a po inkubaci (30 min, 37 °C) se roztok odsaje a jamky 4x promyjí. Přidá se směs konjugátů králičí protilátky vůči lidskému IgG/POD (specifický pro γ-řetězec) a kozí protilátky vůči lidskému IgM/POD (specifický pro μ-řetězec). Imunoreakce se provádí se 30 min při 37 °C, roztok se odsaje a jamky 4x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 30 min ve tmě při 18 – 25 °C) a následně stop činidlo (0,25 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Používá se indexový kalibrátor CMV IgG+IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem ≤ 0,15 jsou negativní, > 0,1 až < 0,5 hraniční, ≥ 0,5 jsou pozitivní. Preciznost v sérii 5,1 – 22,1 %, mezi sériemi 8,4 – 31,8 %. Relativní senzitivita je 99 %, relativní specificita 98,2 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené CMV z E. coli. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí protilátka vůči lidskému IgM značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem ≤ 0,399 jsou negativní, 0,4 – 0,499 hraniční, ≥ 0,500 jsou pozitivní. Preciznost v sérii je 5,6 – 9,1 %, celková preciznost metody je 9,2 – 14,5 %. Relativní senzitivita je 97,0 %, relativní specificita 97,88 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá virový lyzát cytomegaloviru AD169 zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči lidskému IgM značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině CMV IgM a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem < 0,85 jsou negativní, ≥ 1,00 jsou pozitivní. Preciznost v sérii je 3,26 – 6,88 %, celkově 3,33 – 6,88 %. Při 95 % intervalu spolehlivosti je relativní specificita 98,9 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

CLIA (nepřímá chemiluminiscenční analýza) je další trojstupňový zábleskový postup. Během první inkubace (10 min) jsou kalibrátory, vzorky nebo kontroly zředěné pufrem, který obsahuje kozí IgG proti lidským IgG sloužící jako absorpční reagencie k omezení interference lidských IgG specifickým proti lidskému CMV nebo k omezení interference RF. Pak se přidají magnetické částice potažené antigenem CMV AD169, na které naváže během druhé inkubace (10 min) CMV IgM ze vzorku. Po promytí se připojí na další epitop CMV IgM během třetí inkubace (10 min) monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgM značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině CMV IgM. Rozsah měření je na základě dvoubodové rekalibrace vzorové křivky (zadané čárovým kódem) 0 – 240 kU/l (při vyšších hodnotách ředit diluentem 10x). Preciznost v sérii 2,5 – 8,9 %, mezi sériemi 7,3 – 11,6 %. Linearita ředění je 100 – 129,8 %. Relativní senzitivita je 97,3 %, relativní specificita 98,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na třífázové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. CMV IgM se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin a kozí polyklonální protilátka vůči lidskému IgG se inkubují s částečně purifikovaným CMV kmene AD169, imobilizovaným na polystyrénové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. IgM protilátky vůči CMV ze vzorku se naváží na CMV AD169 na kuličce. Kozí protilátky vůči IgG blokují zbývající IgG ze vzorku, aby se nenavázal na CMV AD169 na kuličce. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo CMV IgM naváže polyklonální kozí protilátka vůči lidskému IgM konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci CMV IgM ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky lze dle potřeby ředit manuálně). Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 až < 1,1 jsou neurčité, ≥ 1,1 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 5,1 – 12,5 %, celkem 6,9 – 12,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,22 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvoustupňové reakci a sendvičovém uspořádání. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující CMV IgM, paramagnetické částice potažené inaktivním CMV antigenem. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se ovčí polyklonální protilátka vůči lidskému IgM značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství CMV IgM. Měření se provádí při 470 nm. Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem < 0,8 jsou nereaktivní, ≥ 0,8 až < 1,0 hraniční, ≥ 1,0 jsou reaktivní. Doba analýzy činí 55 min. Preciznost v sérii je 2,3 – 9,2 %, celkem 3,1 – 9,2 %. Relativní senzitivita je 95,9 %, relativní specificita 96,4 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 513 µmol/l neruší.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy CMV IgM ze vzorku reaguje s biotinylovanou myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgM a imunokomplex se zachytí na streptavidin, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (56 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se antigen CMV značený křenovou peroxidázou. Po inkubaci (12 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, ≥ 0,9 až < 1,2 hraniční, ≥ 1,2 jsou reaktivní.  Preciznost v sérii 1,9 – 8,5 %, mezi sériemi je 1,8 – 13,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM. Pak se přidá rekombinantní (E. coli) CMV antigen značený ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině CMV IgM ve vzorku. Používá se indexový kalibrátor CMV IgM (vzorky nelze ředit). Vzorky s indexem < 0,7 jsou nereaktivní, ≥ 0,7 až < 1,0 hraniční, ≥ 1,0 jsou reaktivní. Preciznost v sérii 1,7 – 3,1 %, mezi sériemi 2,4 – 6,1 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 2000 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu.

Hodnoty snižuje: oslabení imunity.

Hodnoty zvyšuje: hemolýza, chylozita, bakteriální kontaminace, antikoagulancia, heterofilní protilátky, zkřížená reaktivita s EBV IgM nebo RF.