dopamine, DA; 3-hydroxytyramin, 3,4-dihydroxyfenethylamin, 2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethylamin;

4-(2-aminoethyl)benzen-1,2-diol

Intropin; Revivan; Oxytyramine

Stanovení se provádí v plazmě – antioxidant glutation, nebo moči. Plazma s heparinem nebo EDTA při 25 °C 24 h, při 4 – 8°C 6 – 48 h, při -20°C 1 – 6 měsíců. Před odběrem dieta (vyloučit sýry, banány, kávu, kakao, aromatické moučníky, alkohol, ovoce, zeleninu, ořechy, nekouřit), 4 h nejíst a nepít, 30 min. ležet se zavedeným žilním katétrem. Krev transportovat v chladu. Moč uchováváme při laboratorní teplotě (před odběrem dodat HCl nebo CH₃COOH) 2 dny – 3 týdny, po okyselení na pH 1,4 při 4 – 8 °C nebo -25 °C 1 rok.

Fluorimetrie je citlivější než fotometrie. Je založena na chemické oxidaci a tautomerizaci adrenalinu, noradrenalinu a dopaminu na jejich trihydroxyindolové deriváty. Před oxidací se moč hydrolyzuje a částečně purifikuje katexovou chromatografií (pH 6,5). Adrenalin a noradrenalin se neodstraňuje, protože při pH 5,3 je fluorescence dopaminu podstatně vyšší. Provede se oxidace ferrikyanidem draselným v přítomnosti zinečnatých iontů. Po alkalizaci se produkt reakce odbarví a přebytek ferrikyanidu se rozloží kyselinou askorbovou. Pro fluorescenci je excitace 405 nm, emise 495 nm. Fluorescenci dopaminu lze zvýšit přídavkem metanolu.

RIA Do jamek s boronátovým afinitním gelem se pipetují standardy, vzorky a extrakční pufr (inkubace 30 min, třepání, laboratorní teplota). Po inkubaci se kapalina vylije a destička vyklepne na papírový ručník, přidá se destilovaná voda, destička se třepe 5 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Přidá se 0,05 M HCl a provede se kyselá hydrolýza 15 min (třepání, laboratorní teplota). Poté se pipetuje do acylačních zkumavek kyselý extrakt, katechol-O-metyltransferáza s koenzymem S-adenosyl-L-metioninem a inkubuje 30 min při 37 °C. Pak se přidá dopamin značený ¹²⁵I a králičí antisérum vůči dopaminu s následnou inkubací 2 h za laboratorní teploty. Po imunoreakci se imunokomplex vysráží druhou protilátkou (kozí proti králičímu IgG) v polyetylenglykolu (15 min, 2 – 8 °C), odstředí a po dekantaci se měří radioaktivita sraženiny 1 min gama-počítačem. Signál na základě šestibodové kalibrace je nepřímo úměrný koncentraci. Rozsah metody sérum 10 – 2000 µg/l dopamin. Analytická citlivost plazma 0,02 µg/l dopaminu, moč 4,5 µg/l dopaminu.

ELISA Do jamek s boronátovým afinitním gelem se pipetují standardy, vzorky a extrakční pufr (inkubace 30 min, třepání, laboratorní teplota). Po inkubaci se kapalina vylije a destička vyklepne na papírový ručník, přidá se destilovaná voda, destička se třepe 5 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Ještě jednou se přidá destilovaná voda, destička se třepe 5 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Přidá acylační činidlo s pufrem a nechá se působit 15 min za laboratorní teploty. Destička se vylije a vyklepne na papírový ručník, přidá se destilovaná voda, destička se třepe 10 min za laboratorní teploty, vypláchne a opět vyklepne na papírový ručník. Následuje kyselá hydrolýza s 0,025 M HCl 10 min za laboratorní teploty (třepání). Takto upravený a naředěný vzorek se pipetuje do jamky mikrotitrační destičky potažené dopaminem. Následně se přidá katechol-O-metyltransferáza s koenzymem S-adenosyl-L-metioninem a inkubuje se 30 min (třepání) za laboratorní teploty. Pak se přidá králičí antisérum vůči dopaminu a inkubuje se 120 min za laboratorní teploty (třepání). Po trojnásobném promytí se přidá protilátka vůči králičímu IgG s peroxidázou a inkubuje se 30 min (třepání) za laboratorní teploty. Po trojnásobném promytí se přidá tetrametylbenzidin a inkubuje se 25 min (třepání) za laboratorní teploty ve tmě. Po přidání stop činidla (0,25 M H₂SO₄) se absorbance odečítá do 10 min při 450/620-650 nm. Naměřený signál je nepřímo úměrný koncentraci dopaminu. Rozsah šestibodové kalibrace 0,0033 – 80 µg/l. Analytická citlivost 0,0033 µg/l, funkční citlivost 0,005 µg/l. Křížová reakce: noradrenalin 0,87 %, 3-metoxytyramin 0,5 %, tyramin 0,13 %, ostatní < 0,1 %. Preciznost v sérii 10,8 – 21,5 %, mezi sériemi 14,8 – 23,0 %; zpětný výtěžek 83,7 – 115,9 %. Jiná metoda s osmi kalibrátory má rozsah měření do 2000 µg/l.

K dispozici je také ELISA v sendvičovém provedení, kdy jsou jamky mikrotitračních destiček potažení kozí protilátkou vůči králičímu IgG – slouží jako kotvící protilátka. Na ní se naváže králičí protilátka vůči dopaminu, pak dopamin ze vzorku (inkubace 120 min), a nakonec protilátka konjugovaná s ALP (inkubace 60 min). Reakce probíhají za laboratorní teploty. Sleduje se reakce (po 40 min) s p-nitrofenylfosfátem při 405/620-650 nm (do 1 h) a absorbance je přímo úměrná množství dopaminu. Rozsah měření je 5 – 2250 µg/l pro dopamin v moči, v plazmě lze měřit koncentrace od 0,004 µg/l. Preciznost v sérii 7 – 11 %, mezi sériemi 13 – 16 %; zpětný výtěžek 70 – 113 %, linearita ředění 88 – 135 %.

GC-MS směs katecholaminů byla vysušena v proudu dusíku a silylována v přítomnosti etylacetátu buď N-metyl-N-(trimetylsilyl)-trifluoracetamidem (MSTFA) nebo N-metyl-bis(heptafluorbutyramidem) (MBHFBA), což se jeví jako nejlepší způsob. Rozsah metody je pro trimetylsilylované deriváty je 20 – 5000 µg/l pro adrenalin a noradrenalin, resp. 5 – 500 µg/l pro dopamin. Chromatografie (kapilára 25 m x 0,2 mm) byla při teplotách 120 – 280 °C. Hmotnostní spektrometr používal režim selektivního monitorování iontů, jako vnitřní standardy byly použity odpovídající izotopy. Takto byl stanoven adrenalin, noradrenalin i dopamin.

HPLC v izokratickém režimu s elektrochemickou detekcí (potenciál 500 mV) je určena ke stanovení adrenalinu, noradrenalinu i dopaminu. Uvedené katecholaminy se vážou na oxid hlinitý v TRIS pufru (třepání 10 min). Po centrifugaci se supernatant dekantuje, přidá se voda, suspenze se protřepe, centrifuguje a supernatant se dekantuje. Postup promytí se ještě jednou opakuje. Pak se uvolní katecholaminy kyselou hydrolýzou (HClO₄). Reakce probíhá 5 min (třepání). Následuje centrifugace a supernatant se opatrně odsaje a může se skladovat 24 h při 4 °C. Chromatografie probíhá na katexu se silikagelem 150 x 4,6 mm. Jako vnitřní standard slouží 3,4-dihydroxybenzylamin. Mobilní fáze je acetonitril s citrátovým a fosfátovým pufrem (pH 6,5). Měřící rozsah 15 – 2000 µg/l pro adrenalin, noradrenalin i dopamin.

LC-MS/MS předchází extrakce do pevné fáze, kterou lze provádět současně u všech šesti analytů. Kapalinová chromatografie trvá 4 min a umožňuje stanovit adrenalin, noradrenalin, dopamin, metanefrin, normetanefrin a 3-methoxytyramin. Jako vnitřní standardy se používají dopamin-D4, noradrenalin-D6, adrenalin-D6, 3-methoxytyramin-D4, normetanefrin-D3, metanefrin-D3 (rozpuštěné v matrici čisté moče). Po kyselé hydrolýze vznikají při extrakci difenylboronátové komplexy, které se snadno zachycují na extrakční koloně C18, v alkalickém prostředí se snadno rozrušují a metanefriny se promývají metanolem s pufrem NH₄Cl-NH₄OH a eluují 5 % kyselinou mravenčí. Chromatografie při 40 °C na pentafluorfenylové koloně (zrno 3 µm) s mobilní fází 0,2 % vodní kyselina mravenčí s metanolem. Hmotnostní spektrometrie používá teplotu plynu 325 °C při napětí v kapiláře 3000 V; sledují se dopamin m/z 154,1 a fragmenty 137,1 a 91,1 spolu s vnitřním standardem dopaminem-D4 m/z 158,1 a jeho fragmentem 141,1. Kalibrace pro adrenalin je 0 – 1000 µg/l. Preciznost v sérii 0,1 – 1,7 %, mezi sériemi 0,3 – 2,7 %; zpětný výtěžek 99,1 – 107,5 %.

Hodnoty snižuje: Parkinsonova nemoc, malnutrice, podání α₂-sympatomimetik, antagonisté kalcia, inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu, α-metyldopa.

Hodnoty zvyšuje: požití většího množství masa, kouření, fyzická námaha, bolestivé stavy, stres, ganglioblastom, neuroblastom, hemodialýza, těhotenství (moč), etanol, kofein, kokain.