NT-proBNP, N-terminal pro-brain natriuretic peptide
Stanovení se provádí v séru nebo raději v plazmě (heparinát amonný nebo lithný; v případě použití K3EDTA jsou výsledky systematicky o 10 % nižší). Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 2 h při doporučené teplotě 20°C. Klid na lůžku před odběrem není nutný.
Stabilita (plazma, sérum): 18 – 26 °C 6 h, 2 – 8 °C 3 dny, -20° C 6 – 12 měsíců. Nemohou být použity vzorky stabilizované azidem. Vzorky obsahující sraženinu musí být centrifugovány. Před analýzou je třeba vzorek vytemperovat na laboratorní teplotu.
Stanovení není ovlivněno ikterem, hemolýzou, chylozitou. Při koncentraci 33,4 nmol/l se ještě neprojevuje efekt nadbytku antigenu.
Stanovení NT-proBNP se provádí imunochemicky soupravami nebo jednoúčelovými kazetami.
ELISA je založena na kompetitivním principu, kdy o čistěnou polyklonální ovčí protilátku specifickou vůči NT-proBNP (vázanou na mikrotitrační destičce) soutěží peptid ze vzorku a peptid značený křenovou peroxidázou. Po odstranění volné frakce se přidá substrát tetrametylbenzidin a barevná změna po zastavení reakce s peroxidázou se sleduje fotometricky. Mez stanovitelnosti: 5,9 pmol/l (CV < 20 %). Linearita metody je v rozsahu 2,36 – 2950 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 1,5 – 2,8 %, mezi sériemi 3,4 – 5,1 %, mezi šaržemi 3,5 – 8,4 %. Klinická senzitivita: 91,9 %; klinická specifita: 92,9 %.
Princip kompetitivní ELISA může být i mnohem složitější, kdy je protilátka navázaná na oxidu chromičitém a druhá protilátka označená ALP. Kaskáda enzymových reakcí přes prolinoxidázu a křenovou peroxidázu končí Trinderovou reakcí. Mez detekce je 0,24 pmol/l. Celková reprodukovatelnost byla 2,6 – 14,7 % a výtěžnost 98,4 – 104,7 %.
Chemiluminiscence je založena na sendvičovém principu. Kuličky jsou potaženy ovčí polyklonální protilátkou vůši NT-proBNP a druhá protilátka je značená ALP s telecího střeva. Po separaci imunokomplexu se sleduje chemiluminiscence vznikající rozkladem substrátu adamantyldioxetanfenylfosfátu ALP. Kalibrační rozsah metody je 2,4 – 4 130 pmol/l, analytická citlivost 1,2 pmol/l. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 2,3 – 5,4 %, celková 4,0 – 6,4 %; linearita 97 – 121 %, výtěžnost 92 – 131 %.
Chemiluminiscence může používat také kompetitivní postup, kdy je protilátka v mikrotitrační jamce vázána streptavidin-biotinovým můstkem. O její vazebná místa soutěží NT-proBNP ze vzorku a konjugát NT-proBNP s křenovou peroxidázou. Po separaci volných reaktantů se sleduje luminiscenční reakce s luminolem. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 0,7 – 1,3 %, mezi kalibracemi 1,7 – 6,0 %, mezi laboratořemi 1,8 – 5,5 %; výtěžnost 94,8 – 97,2 %.
Elektrochemiluminiscence používá dvou polyklonálních ovčích protilátek. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou ovčí polyklonální protilátkou, specifickou vůči N-terminální frakci BNP (NT-pro BNP) a ovčí polyklonální protilátkou, specifickou vůči NT - pro BNP značenou ruthéniovým komplexem a vzniká sendvičový imunokomplex. Pak se přidají mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. U pacientů, kteří dostávají vysoké dávky biotinu (např. > 5 mg/den), mohou být vzorky odebrány nejdříve za 8 hodin po podání poslední dávky biotinu. Linearita metody je v rozsahu 0,59 – 4130 pmol/l. Mez detekce je 0,6 pmol/l (2 SD), mez stanovitelnosti: 5,9 pmol/l (CV < 20 %). Reprodukovatelnost v sérii byla CV 1,8 – 2,7 %, mezi sériemi 2,2 – 3,2 %. Klinická senzitivita: 88 %; klinická specifita: 92 %.
Na principu fluorescenční detekce se také používají také jednoúčelové kazety. Při hodnocení na fluorimetru je mez detekce 2,1 pmol/l, mez stanovitelnosti: 6,7 pmol/l (CV ≤ 20 %). Reprodukovatelnost v sérii CV 5,5 – 9,4 %, mezi dny 8,9 – 10,3 %.
HPLC má čistě výzkumný charakter. Na reverzní fázi s acetonitrilem jako mobilní fázi byl použit vnitřní standard rekombinantní lidský NT-proBNP1–37–NT-proANP29–98. Reprodukovatelnost v sérii byla CV 4,7 – 6,0 %, mezi sériemi 10 – 12 %; výtěžnost byla 91,7 – 97,7 %.
Doporučená metoda ani certifikovaný materiál nebyly ještě v roce 2010 k dispozici.
Tolerační rozmezí EKK je 30 %.
Bilirubin může interferovat se stanovením NT-proBNP u vzorků nižších než 59 pmol/l; způsobuje snížení hodnot.
