FVIII, FVIII:C, F8, antihemofilický faktor A, antihemofilický globulin, destičkový kofaktor I

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla > 1 min. Transport materiálu do laboratoře do 2 h. Stabilita plazmy je 4 h při 15 – 25 °C. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

V případě zamrazení plazmy se upřednostňuje opakovaná centrifugace a oddělení plazmy 0,5­­ – 1,0 cm nad suspenzí erytrocytů. Plazmu lze skladovat 4 týdny při teplotě -20 °C nebo 6 měsíců při teplotě -70°C . Pro následné zpracování zamrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu cca 5 min ve vodní lázni o teplotě 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.

Faktor VIII je plazmatický glykoprotein a koagulační faktor o molekulové hmotnosti 330 kDa. Patří mezi neenzymatické koagulační kofaktory, stejně jako FV. Patří mezi pozitivní reaktanty akutní fáze zánětu. V plazmě koluje vázaný nekovalentní vazbou na von Willebrandův faktor (vWF) v poměru 1:1. Z této vazby se FVIII uvolní při kontaktu s negativně nabitým fosfolipidovým povrchem. Volný faktor VIII je aktivován na FVIIIa působením trombinu (faktor IIa) nebo faktoru Xa. Faktor VIIIa poté tvoří komplex (vnitřní tenáza) s faktorem IXa, membránovými fosfolipidy a Ca²⁺, který aktivuje faktor X na faktor Xa. Faktor VIII má v komplexu funkci kofaktoru, až 10000x urychluje aktivaci faktoru X.

V praxi se používají koagulační testy, založené na principu aPTT, které měří funkční aktivitu. Vzorek plazmy se ředí pufrem (1:10) a smíchá se s FVIII deficitní plazmou. Po krátké inkubaci se provede aPTT test, měříme dobu vzniku koagula. Aktivitu faktoru zjistíme odečtením z kalibrační křivky.

Kalibrace se provádí pomocí kalibrační plazmy o známém obsahu FVIII v %. Postupuje se tak, že si připravíme řadu ředění kalibrační plazmy s pufrem (např. 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/80, 1/100, 1/1000), čímž získáme vzorky o známé koncentraci (v případě 100 % obsahu FVIII v kalibrační plazmě to bude 100 %, 50 %, 33 %, 25 %, 12,5 %, 10 %, 1 %). Dále s každým ředěním provedeme test aPTT. Kalibrační závislosti je nejčastěji log-log. Výchozí ředění a počet kalibračních bodů je možné přizpůsobit systému a citlivosti použité reagencie. Faktor VIII deficitní plazma je dodávaná komerčně. Použití plazmy získané od pacientů s hemofilií A s aktivitou FVIII < 1% se nedoporučuje, jelikož v praxi je důležité hodnotit i vzorky s tak nízkou hladinou faktoru VIII. Pro přesnější měření se často volí dvě kalibrační křivky a to první pro normální hodnoty až 10 % a druhá pro hodnoty 10 % a méně. Na druhé straně se aktivita faktoru VIII měří i u trombofilních stavů, kde jsou zajímavé hodnoty nad 150%. To je možné řešit buď odlišnou kalibrační křivkou, nebo v praxi se více používá vyšší ředění vyšetřovaného vzorku, např. 1/20, kde po odečtení z kalibrační křivky se výsledek vynásobí faktorem ředění, v tomto případě 2. Precíznost metody závisí od typu analyzátoru a použité APTT reagencie, nesmí však přesahovat 10%.

Nejčastější typ detekce je optický (turbidimetrie) a mechanický (kovová kulička v magnetickém poli). Obě metody mají své výhody i nevýhody. Optické metody jsou finančně méně náročné, jelikož stačí převážně 150 µl reakční směsi v kyvetě, kdež to u mechanické detekce je nutný objem větší, aby se kulička celá ponořila. Mechanická detekce na druhé straně není závislá na zbarvení, resp. zakalení vzorku (ikterické, chylózní, hemolytické vzorky), což lze u optické metody minimalizovat detekci při 671 nm. U optických analyzátorů je nutné zohlednit i způsob odečtu času koagulace z reakční křivky. Většina přístrojů volí inflexní bod křivky nebo 50 % absorbance, kde počáteční absorbance se bere jako 0 % a konečná 100 %. Nejvhodnější je způsob odečtu matematickým zpracováním křivky a to její druhou derivací, kde koagulační čas se odečte v maximu druhé derivace původní reakční křivky. Je to část křivky, kde dochází k největšímu nárůstu koagula.

Chromogenní test – je test při kterém se ředěný vyšetřovaný vzorek inkubuje s trombinem, fosfolipidy, vápenatými ionty a s nadbytkem aktivovaného faktoru IX. V závislosti na množství FVIII ve vyšetřovaném vzorku vznikne tzv. vnitřní tenáza, která v dalším kroku štěpí přidaný faktor X, za vzniku jeho aktivované formy (FXa). Aktivovaný faktor X pak štěpí chromogenní substrát za uvolnění p-nitroanilinu, který je detekován při 405 nm. Závislost je přímo úměrná a koncentrace se odečte z kalibrační křivky. Tato metoda není citlivá na přítomnost heparinu, lepirudinu, lupus antikoagulans a lipidového zákalu. Měřící rozsah je 20 – 150 % s preciznostív sérii 3,4 %, mezi seriemi  5,3 % a 1 – 20 % s precizností v sérii 4,3 % a mezi sériemi 5,6 %. V jiném testu je měřící rozsah 5 - 200 % resp. <1 - 25 % s detekčním limitem 10 % resp. 0,2 % a precíznosti v sérii 3-5 % a mezi sériemi 4-7 %. 

Imunologické metody stanovují antigen FVIII a tudíž neodrážejí jeho funkční aktivitu.

Převážná část vzorků poskytuje rovnocenné výsledky v těchto testech, nicméně některé mutace v molekule FVIII poskytují rozdílné výsledky. Obecně chromogenní metoda lépe koreluje s klinickými projevy, a vzhledem k přesnější fotometrické detekci a citlivosti v celém měřícím rozsahu byla přijatá jako referenční.

Intraindividuální CV je 4,8 %

Aktivita koagulačních faktorů se může vyjadřovat v % nebo v IU/dl nebo IU/ml. To je důležité u kalibrační plazmy a tyto jednotky nelze zaměňovat. V případě jednotek IU/dl nebo IU/ml se jedná o hodnoty vztažené na mezinárodní standard. Vzhledem k SI se upřednostňuje IU/ml, případně kIU/l (resp. U/ml, případně kU/l).

Hodnoty snižuje: odběr menšího množství krve, špatný odběr krve (aktivace koagulace), vysoký hematokrit, pozdní promíchání vzorku po odběru, odběr z kanily, odběr po krevní transfuzi, fyziologicky novorozenci, u krevní skupiny 0, inhibitory FVIII.

Hodnoty zvyšuje: nedodržení poměru s antikoagulačním činidlem (přeplnění zkumavky), hemolytická plazma (aktivace koagulace erytrocytární složkou), nízký hematokrit, odběr u sedícího a stojícího pacienta, gravidita, intenzívní míchání vzorku, tělesná námaha, alkohol, stres, vyšší u krevních skupin A, B, AB, zánět, traumata, větší operační zákroky; léky: hormonální antikoncepce, kortikosteroidy, desmopresin.