Hepatitis B Core Viral  IgM Antibody; Hepatitis B Core IgM Antibody; Hepatitis B Core IgM Specific, Hepatitis B Core Antibody IgM Fraction, Hep B Core Ab IgM, HEP B CORE AB IgM, IgM ANTI-HBC, HBc Ab IgM, HBC AB IgM

Stanovení se provádí v séru (plazmě – antikoagulans EDTA, heparin, citrát). Stabilita za laboratorní teploty 2d, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C dlouhodobě.

Všechny soupravy jsou určeny pro kvalitativní stanovení.

IRMA analýza se používá již omezeně, i když stále existují komerční soupravy na trhu. Obvykle se sleduje sekvenční reakce protilátkou vůči lidskému IgM, vázanou na stěně zkumavky a anti-HBc ze séra. Po inkubaci 60 min a promytí se přidá HBc a anti-HBc značený ¹²⁵I a provede se druhá inkubace 60 min. Radioaktivita je po vymytí přímo úměrná množství anti-HBc IgM v séru.

ELISA Ve vyšetřovaném vzorku přítomné HBc IgM protilátky se navážou na povrch jamky mikrotitrační destičky s fixovanými monoklonálními protilátkami vůči lidskému IgM (Inkubace 15 – 30 min při 18 – 25 °C. Na specifické HBc IgM protilátky se naváže HBc antigen, konjugovaný s peroxidázou (Inkubace 60 min při 37 °C). Po odstranění nadbytečného konjugátu a nenavázaných součástí vzorku promytím (5x) se provede enzymatická reakce navázaného konjugátu při 18 – 25 °C 30 min ve tmě (modrá barevná reakce). Enzymatická přeměna chromogenu se přeruší přidáním zastavovacího roztoku (1M H₂SO₄ – žlutá barevná reakce). Intenzita zbarvení (450/615-690 nm) je přímo úměrná koncentraci anti-HBc IgM ve vzorku. Měření je třeba provést do 1 h. Absorbance negativní kontroly + 0,07 je cut-off (může se dodávat také indexový kalibrátor a cutoff je pak jeho absorbance + 0,2). Negativní výsledky < cutoff - 10 %, hraniční výsledky cutoff ± 10 %, pozitivní > cutoff + 10 %. Preciznost v sérii je 4,3 – 6,8 %, mezi sériemi 5,8 – 16,9 %. Relativní specificita 99,6 %. Lipemické, ikterické nebo hemolytické vzorky výsledek testu neovlivňují. V ojedinělých případech při vysokých hladinách revmatoidních faktorů doprovázených vysokým titrem anti-HBc IgM se mohou objevit zvýšené naměřené hodnoty. Zvýšené jaterní aminotransferázy a autoprotilátky ANA rovněž neinterferují.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá myší monoklonální protilátky vůči lidskému IgM zakotvené na paramagnetických částicích, ke kterým se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá jaderný antigen rekombinantního viru hepatitidy B značený akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HBc IgM a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Dvoubodová kalibrace (oba kalibrátory v tripletu) slouží pro kvalitativní hodnocení. Vzorky, které mají index cut-off  (A kalibrátoru 2 + 0,25A kalibrátoru 1) ≥ 1,00 jsou reaktivní na anti-HBc IgM, < 1,00 jsou nereaktivní.  Preciznost v sérii je 3,15 – 13,34 %, mezi sériemi 4,13 – 14,53 %. Relativní senzitivita je 98,2 %, relativní specificita 99,7 %. Vzorky od pacientů s vysokými hladinami protilátek třídy IgM, např. od pacientů s mnohočetným myelomem, mohou vykazovat snížené hodnoty při testovaní metodami, které využívají reagencie obsahující protilátky proti lidskému IgM. Neruší hemoglobin 5 g/l, bilirubin 342 µmol/l ani triacylglyceroly 33,9 mmol/l.

CLIA je další sendvičový dvojstupňový zábleskový postup, kdy anti-HBc IgM ze vzorku se naváže během první inkubace (10 min) na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči lidskému IgM. Po promytí se přidá konjugát rekombinantního HBcAg značený izoluminolem a proběhne další inkubace (10 min). Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HBc IgM. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / cut-off) ≥ 1,1 jsou reaktivní na anti-HAV IgM, < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 – 1,1 jsou reaktivní v šedé zóně (vyšetření opakovat v týdenních intervalech). Preciznost v sérii 2,5 – 5,0 %, mezi sériemi 3,5 – 14,2 %. Relativní senzitivita je 99,1 %, relativní specificita 99,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 5,6 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na dvoustupňové sekvenční imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči HBc ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin reagují s monoklonální myší protilátkou vůči lidskému IgM imobilizovanou na polystyrénové kuličce; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se přidá rekombinantní HBcAg konjugovaný s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-HBc IgM ve vyšetřovaném vzorku. Používají se dva kalibrátory. Rozsah měření 2 – 100 kU/l. Vzorky < 10 kU/l jsou nereaktivní, ≥ 10 kU/l jsou reaktivní.Analytická citlivost ≤ 2,5 kU/l. Preciznost v sérii je 3,2 – 6,6 %, celková 5,3 – 8,1 %. Relativní senzitivita je 99,4 %, relativní specificita 100 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvoustupňové reakci a sendvičovém uspořádání. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující anti-HBc IgM a paramagnetické částice potažené ovčí polyklonální protilátkou vůči lidskému IgM (řetězec µ). Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se konjugát rekombinantního HBcAg značený ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství anti-HBc IgM. Měření se provádí při 470 nm. Analýza trvá 35 min; používají se dva kalibrátory (negativní a pozitivní). Cut-off se určuje v dubletu u negativního a v tripletu u pozitivního kalibrátoru. Vzorky s indexem cut-off < 0,8 jsou nereaktivní na anti-HBc IgM, 0,8 až < 1,0 jsou neurčité, ≥ 1,0 jsou reaktivní na anti-HBc IgM. Preciznost v sérii je 3,0 – 6,9 %, mezi sériemi 2,7 – 13,2 %. Relativní senzitivita je 97 %, relativní specificita 98,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 40,7 mmol/l a bilirubinu 136,8 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy anti-HBc IgM ze vzorku reaguje s biotinylovanou myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgM a imunokomplex se zachytí na streptavidin, kterým jsou potaženy jamky mikrotitrační destičky. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se rekombinantní HBcAg s navázanou monoklonální myší protilátkou vůči HBcAg značenou křenovou peroxidázou. Po inkubaci (37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Celkově trvají inkubace 32 min a první výsledek je k dispozici za 43 min. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál je přímo úměrný množství anti-HBc IgM. Používá se indexový kalibrátor anti-HBc IgM. Vzorky s indexem < 0,8 jsou nereaktivní na anti-HBc IgM, ≥ 0,8 až < 1,2 hraniční, ≥ 1,2 jsou reaktivní na anti-HBc IgM.  Preciznost v sérii 0,5 – 20 %, mezi sériemi je 1,4 – 40 %. Relativní senzitivita je 98,2 %, relativní specificita 100 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze. Biotin v séru zůstává zvýšený až 24 h po orálním nebo intravenózním podání.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) se ředí diluentem a je inkubován ovčí protilátkou vůči lidskému Fdg (slouží k blokování IgG). Pak se přidá s biotinylovaná monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgM, rekombinantní HBcAg značený ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm a je přímo úměrná množství anti-HBc IgM. Výsledky jsou stanoveny na základě dvoubodové kalibrace, kdy je automaticky vypočtená hodnota cut-off. Vzorky s indexem < 1,0 jsou nereaktivní, ≥ 1,0 jsou reaktivní na anti-HBc IgM (neprůkazné rozmezí 0,9 – 1,1). Preciznost v sérii 1,5 – 4,5 %, mezi sériemi 1,8 – 4,1 %. Relativní specifičnost je 98,7 %. Hemolýza (hemoglobin 20 g/l), chylozita (triacylglyceroly 17 mmol/l), ikterus (bilirubin 428 µmol/l) a RF (< 4200 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Falešná negativita: v přítomnosti imunokomplexů HBsAg/anti-HBsAg.

Falešná pozitivita: nespecifické zvýšení při negativitě HBsAg, abnormality spojené s jaterními enzymy.