C-peptid inzulínu, spojovací peptid proinzulínu;

C-peptide, connecting peptide insulin, insulin-connecting peptide, insulin C-peptide, proinsulin C-peptide

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparin nebo citronan – nepoužívat EDTA nebo NaF! – někteří výrobci naopak nedoporučují heparin a doporučují EDTA) nebo moči (jednorázový odběr nebo sběr za 24 h se skladováním ve tmě a chladu). Vhodné je vyšetření po zátěži. Zpracování vzorku krve do 3 h. Stabilita v plazmě a séru: 3 h při 15 – 25 °C, 1 – 7 d při 4 – 8 °C, 1 – 3 měsíce při -20 °C. Pro prevenci rozkladu se doporučuje přídavek Trasylolu (2000 kU/l). Opakované rozmrazování vzorku se nedoporučuje. Při stanovení ruší hemolýza. Stabilita v moči: 24 h při 2 – 8 °C, 1 měsíc při -20 °C.

IRMA používá myší monoklonální protilátku vůči C-peptidu vázanou na stěnu zkumavky, na kterou se váže C-peptid ze vzorku a pak na něj druhá myší monoklonální protilátka vůči C-peptidu značená ¹²⁵I. V soupravě jsou použity monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům molekuly C-peptidu. Imunoradiometrické stanovení C-peptidu (vytvoření sendviče) probíhá v jednom kroku. Nejprve se do zkumavek dávkují standardy a vzorky, pak druhá protilátka značená ¹²⁵I. Zkumavky se jemně protřepou a nechají inkubovat 2 h při 18 – 25 °C (třepání). Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a dvakrát propláchne a odsaje. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace C-peptidu v kalibrátorech a vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení šesti sérových kalibrátorů a hodnoty C-peptidu přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Rozsah stanovení je 3,8 – 6400 pmol/l (vyšší koncentrace C-peptidu se ředí diluentem). Analytická citlivost je 3,79 pmol/l, funkční citlivost 13,9 pmol/l. Preciznost v sérii ≤  3,1 % (sérum), ≤ 3,2 % (moč), mezi sériemi ≤  5,2 % (sérum), ≤ 4,8 %; linearita ředění je 96 – 114 % (sérum), 86 – 105 % (moč), zpětný výtěžek 83 – 105 % (sérum), 84 – 104 % (moč). Křížová reakce s proinzulinem je 3 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 50000 pmol/l. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

K dispozici je i kompetitivní varianta. Nejprve se do zkumavek dávkují standardy a vzorky, pak konjugát C-peptidu s ¹²⁵I a nakonec antisérum vůči C-peptidu. Kompetitivní imunoreakce se nechá probíhat buď 4 h při 15 – 28 °C nebo 14 – 16 h při 2 – 8 °C. Pak se přidá precipitační fyziologický roztok PEG s kozím protikráličím IgG. Po protřepání a centrifugaci se supernatant odsaje nebo dekantuje a sraženina měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace C-peptidu v kalibrátorech a vzorcích je nepřímo přímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení šesti sérových kalibrátorů a hodnoty C-peptidu přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Rozsah stanovení je 33 – 6620 pmol/l (vyšší koncentrace C-peptidu se ředí diluentem). Analytická citlivost je 72,8 pmol/l (kratší inkubace), 16,5 pmol/l (delší inkubace). Preciznost v sérii 3,0 – 5,3 % (sérum), mezi sériemi 1,9 – 10,0 (sérum); linearita ředění je 98 – 104 % (sérum), 103 – 114 % (moč), zpětný výtěžek 101 – 116 % (sérum), 94 – 106 % (moč). Křížová reakce s proinzulinem je až 20 %. Bilirubin > 171 µmol/l způsobuje falešně vyšší výsledky.

ELISA je založena na sendvičovém principu, kdy na monoklonální myší protilátku (vázanou na mikrotitrační destičce) se naváže C-peptid ze vzorku (1 h třepání). Po šestinásobném promytí se připojí k jinému místu C-peptidu druhá monoklonální myší protilátka značená křenovou peroxidázou (1 h třepání). Po šestinásobném promytí se přidá substrát tetrametylbenzidin a barevná změna reakce s peroxidázou (15 min) se sleduje do 30 min po zastavení stop činidlem (0,5 M H₂SO₄) a protřepání fotometricky při 450 nm. Analýza probíhá při laboratorní teplotě. Mez detekce: 15 pmol/l. Rozsah měření je na základě šestibodové kalibrace 100 – 4000 pmol/l (vyšší koncentrace a vzorky moče se ředí nulovým kalibrátorem). Signál je přímo úměrný koncentraci C-peptidu ve vzorku. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1750000 pmol/l. Preciznost v sérii byla CV 2,9 – 4,8 %, mezi sériemi 0,6 – 4,8 %; zpětný výtěžek 93 – 113 % (sérum), 94 – 107 % (moč). Křížová reakce s proinzulinem je < 1,8 %. Lipemické, ikterické a hemolytické vzorky neinterferují při stanovení.

Ultracitlivá varianta soupravy ELISA má mez detekce 2,5 pmol/l a rozsah měření 5 – 250 pmol/l.

Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní (sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. C-peptid se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na myší monoklonální protilátku značenou esterem akridinu. Následně se přidává monoklonální myší protilátka, která je kovalentně vázaná na paramagnetické částice niklu. Reakce probíhá 7,5 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci C-peptidu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě sedmibodové základní kalibrace při použití nových šarží činidel a dvoubodové rekalibrace po dvou nejpozději však čtyřech týdnech. Linearita metody je do 9930 pmol/l. Vzorky s koncentrací C-peptidu vyšší než 9930 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Používané manuální nebo automatické ředění je 2x nebo 5x pro sérum a 10x pro moč. Naměřený výsledek obsluha nebo přístroj násobí 2x, 5x nebo 10x. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 66200 pmol/l. Detekční limit metody je 16,5 pmol/l. Preciznost v sérii: 3,7 – 4,1 % (sérum), 4,1 – 4,7 % (moč); mezi sériemi: 1,0 – 3,3 % (sérum), 3,6 – 5,1 % (moč). Zpětný výtěžek:  97,8 – 108,8 % (sérum), 96,9 – 105,0 % (moč); linearita ředění: 84,1 – 106,3 % (sérum), 96,6 – 119,9 % (moč). Při metodě neruší: hemoglobin do koncentrace 2,5 g/l, triacylglyceroly do koncentrace 11,3 mmol/l a bilirubin do koncentrace 342µmol/l. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

CLIA je další jednostupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během inkubace (10 min) C-peptid a druhá monoklonální protilátka značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině C-peptidu. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 3,3 – 9330 pmol/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby, moč alespoň 10x). Analytická citlivost je 3,3 pmol/l. Preciznost v sérii 1,0 – 4,3 %, mezi sériemi 2,6 – 6,8 %. Linearita ředění je 94,3 – 102,2 % (moč), zpětný výtěžek 97 – 101 % (moč). Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 66200 pmol/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (5 g/l), bilirubinu (214 µmol/l) a triacylglycerolů (14,1 mmol/l) neruší. Křížová reakce s proinzulinem je 3 %.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. C-peptid se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce a druhým epitopem na monoklonální myší protilátku konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci C-peptidu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je 33,1 – 6620 pmol/l. Vzorky s koncentrací C-peptidu vyšší než 6620 pmol/l se ředí univerzálním diluentem (moče vždy alespoň 5x). Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1178360 pmol/l. Detekční limit metody: 16,6 pmol/l (2 SD), citlivost: 29,8 pmol (CV ≤ 20 %). Preciznost v sérii: 1,9 – 3,3 %, celková: 3,8 – 5,5 %. Zpětný výtěžek:  94 – 110 %, linearita ředění 79 – 110 %. Hemoglobin do koncentrace 5 g/l ani triacylglyceroly do 33,9 mmol/l neinterferují. Bilirubin do koncentrace 342µmol/l vykazuje negativní interferenci až 25 %. Křížová reakce s proinzulinem je 10,5 %. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních.

Jako marker lze použít také křenovou peroxidázu a luminiscenčním substrátem je pak luminol. Při sendvičovém stanovení v mikrotitračních destičkách jsou použity myší monoklonální protilátky vůči dvěma různým epitopům C-peptidu. Vzorky a kalibrátory se nejprve inkubují v jamkách potažených první monoklonální protilátkou (1 h, 37 °C, třepání). Po inkubaci se obsah jamek promyje 4x a přidá se do nich konjugát druhé protilátky s křenovou peroxidázou. Po druhé inkubaci (1 h, 18 – 25 °C, bez třepání) se opět jamky 4x promyjí, aby se odstranil nenavázaný konjugát. Přidá se signální činidlo (luminol) a započne peroxidázou katalyzovaná luminiscenční reakce. Emitovaný světelný signál se měří luminometrem mezi 5. a 15. minutou. Koncentrace C-peptidu ve vzorcích je přímo úměrná změřenému světelnému signálu a získá se interpolací z šestibodové kalibrační křivky. Rozsah stanovení je 5 – 6400 pmol/l. Analytická citlivost je 5 pmol/l, funkční citlivost < 1,2 pmol/l. Preciznost v sérii ≤ 5,1 %, mezi sériemi ≤ 6,5 %. Linearita ředění je 96 – 117 %, zpětný výtěžek 92 – 112 %. Pacienti, kteří byli pravidelně ve styku se zvířaty nebo podstoupili imunoterapii nebo diagnostické procedury využívající imunoglobuliny nebo fragmenty imunoglobulinů, mohou produkovat protilátky, které interferují při imunologických stanoveních. Heparinová plazma se nedoporučuje.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči C-peptidu. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči C-peptidu a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje 60 min při 23 °C s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-C-peptid-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi (inkubace 30 min při 23 °C ve tmě). Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolní singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 615 nm a je přímo úměrný koncentraci C-peptidu ve vzorku. Rozsah metody je 7,8 – 9930 pmol/l (ředění umožňuje zvětšit rozsah měření). Detekční limit je 7,8 pmol/l, funkční citlivost 16,4 pmol/l. Preciznost v sérii 3,9 – 4,8 %, mezi sériemi 7,7 – 11,8 %. Linearita ředění 67 – 100 %, zpětný výtěžek 105 – 114 %. Křížová reakce s proinzulinem je 0,5 %.

Biologický poločas 11 minut.

Mezinárodní referenční standard je C-peptide 84/510.

Toleranční limit EHK: 20 %.

Snížené hodnoty sérum, plazma: hladovění, hypoinzulinismus, Addisonova nemoc, pankreatektomie, tělesné cvičení, spánek, hemolýza (vliv erytrocytární peptidázy); léky: inzulín, ILGF-I.

Snížené hodnoty moč: věk (-0,5 % roční úbytek), cvičení.

Zvýšené hodnoty sérum, plazma: snížená funkce ledvin, hyperinzulinismus, inzulinom, obezita, transplantáty β-buněk pankreatu, masitá strava, kouření, cukry, těhotenství, glukagon, bilirubin, věk (+0,4 % roční přírůstek), alanin, banány, čokoláda, škrob; léky: danazol, etinylestradiol, perorální hypoglykemika, chlorochin, perorální kontraceptiva.

Zvýšené hodnoty moč: BMI (vzrůst +0,6 % C-peptid/kreatinin na jednotku BMI), nitrožilní výživa pacientů.