tkáňový aktivátor plazminogenu, tPA, TPA, tissue plasminogen activator

EC 3.4.21.68

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla > 1 min. Transport materiálu do laboratoře ihned, nejdéle do 2 h. V případě vyšetření funkční aktivity je nutný transport na tajícím ledu. Stabilita plazmy je 4 h při 15 – 25 °C. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

V případě zamrazení plazmy se upřednostňuje opakovaná centrifugace a oddělení plazmy 0,5 – 1,0 cm nad suspenzí erytrocytů. Plazmu lze skladovat 4 týdny při teplotě -20 °C nebo 6 měsíců při teplotě -70°C. Pro následné zpracování zamrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu 5 min ve vodní lázni o teplotě 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.

Odběr je doporučeno provádět nalačno v dopoledních hodinách, s vynecháním alkoholu jeden den a cigaret minimálně hodinu před odběrem.

Tkáňový aktivátor plazminogenu je serinová proteáza, která štěpí plasminogen na plasmin. Účinnost reakce se zvyšuje v přítomnosti fibrinových vláken, které obsahují vazebná místa pro tPA i plasminogen (koncentrace v místě sraženiny). Biologický poločas tPA je přibližně 5 min. Laboratorní hodnocení hladin t-PA je komplikované z hlediska kolísání tPA v krvi (reaktant akutní fáze, diurnální variace), jakož i kolísání jeho inhibitoru PAI-1(reaktant akutní fáze, denní kolísání) s kterým vytváří inaktivní komplex.

Na stanovení t-PA je možné použít imunologické nebo funkční testy.

Imunologické testy stanovují antigen tPA. Nejběžnější je ELISA, kde na mikrotitračních destičkách je navázaná specifická protilátka vůči tPA. Po inkubaci se vzorkem a promytí se použije druhá protilátka, která je biotinylovaná. V další fázi se použije streptavidin-peroxidázový konjugát. Reakce se detekuje při 450nm pomocí TMB (tetrametylbenzidin) a peroxidu vodíku. V tomto provedení je absorbance přímo úměrná koncentraci t-PA ve vzorku. Senzitivita testu je 0,03 µg/l, měřící rozsah 0,031 µg/l – 2 µg/l, zpětný výtěžek 86 – 114 %, precíznost v sérii je 4,9%, mezi sériemi 7,1%.

V jiném provedení je na pevné fázi vázaná protilátka vůči tPA. Po inkubaci vzorku s pevnou fází se nenavázané součásti odstraní promytím. V dalším kroku se přidá plasminogen, který je navázaným tPA štěpen na plasmin. Množství vzniklého plasminu se detekuje specifickým chromogenním substrátem, z kterého se uvolňuje p-nitroanilin. Detekce je fotometrická při 405 nm.

Funkční testy:

V chromogenním provedení se k vyšetřovanému vzorku přidá standardní množství plasminogenu, který je t-PA ze vzorku štěpen na plasmin. Uvolněný plasmin pak štěpí specifický chromogenní substrát za uvolnění p-nitroanilinu. Uvolněné žluté zbarvení se detekuje při 405nm. Senzitivita testu je 0,036 IU/ml, měřící rozsah 0,039 IU/ml – 40 IU/ml. 

Hodnoty snižuje: pozdní zpracování.

Hodnoty zvyšuje: heparin, akutní fáze zánětu, akutní infarkt myokardu, septický šok, postoperační stavy, těhotenství, venostáza, vyšší věk, tělesné cvičení, stresové stavy.