AFP, a-fetoprotein, alfa-1-fetoprotein, alfa-fetoglobulin

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA, heparin nebo citrát), výjimečně v likvoru nebo amniové tekutině. Některé prameny stanovení v plazmě nedoporučují. Odběr při screeningu vrozených vývojových vad 15. -19. týden, opakovaný odběr za týden pokud jsou hodnoty vysoké. Hemolýza při stanovení ruší. Stabilita v plné krvi při 4 – 8 °C i při 15 – 25 °C 5 d. Stabilita v séru při 4 – 8 °C 3 – 7 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců. Je třeba vyloučit opakované rozmrazení.

Elektroimunodifuze s imunoprecipitací využívá migrace AFP v elektrickém poli na agarózovém gelu, který obsahuje protilátku vůči AFP. Vzdálenost precipitační linie od startu odpovídá AFP a její plocha pak koncentraci AFP. Metoda není dost citlivá, občas je popsána u analýzy amniové tekutiny.

RIA v kompetitivním uspořádání je založena na soutěži ¹²⁵I-AFP a AFP ze vzorku o vazebná místa králičí protilátky vůči AFP (inkubace trvá 18 h). Oddělení imunokomplexu od volných antigenů lze docílit přidáním druhé protilátky s následnou precipitací nebo je už první protilátka imobilizována na stěně zkumavek či v jamkách mikrotitračních destiček. Metoda je použitelná v rozsahu 1,5 – 400 µg/l. Preciznost v sérii je 7 %, mezi sériemi 8 %. Protože je pomalá, tak se už dnes nepoužívá.

IRMA používá protilátku vůči AFP vázanou na pevnou fázi, na kterou se váže AFP ze vzorku a pak na něj druhá protilátka vůči AFP značená ¹²⁵I. V soupravě jsou použity myší monoklonální protilátky proti dvěma různým epitopům molekuly AFP. Imunoradiometrické stanovení AFP probíhá ve dvou krocích. Nejprve se ve zkumavkách potažených první monoklonální protilátkou inkubují vzorky nebo kalibrátory (15 min, třepání). Po inkubaci se obsah zkumavek odsaje a přidá se do nich druhá protilátka značená ¹²⁵I. Po druhé inkubaci (30 min, třepání) se odsaje obsah zkumavek a vymyje se nenavázaná značená protilátka. Vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace alfa-fetoproteinu v kalibrátorech a vzorcích je přímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení šesti sérových kalibrátorů a hodnoty AFP přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Stanovení se provádí za laboratorní teploty. Rozsah stanovení je 0,13 – 482 µg/l. Analytická citlivost je 0,11 µg/l, funkční citlivost je 0,24 µg/l. Preciznost v sérii 3,0 – 6,9 %, mezi sériemi 6,3 -10,9 %. Linearita ředění je 86 – 112 %, zpětný výtěžek 88 – 119 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Neizotopové značení používá jako marker enzym, fluorofor nebo luminofor. Tyto postupy se používají nejvíce.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou monoklonální myší protilátkou vůči AFP. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje se 5 min, pak se přidá monoklonální protilátka vůči AFP s navázanou křenovou peroxidázou.  Po inkubaci (1 h) a promytí 4x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 30 min je zastavena stop činidlem (2 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450±10 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Neruší vysoké koncentrace triacylglycerolů, bilirubinu ani heterofilní protilátky. Rozsah měření na základě šestibodové kalibrace je 0 (?) – 350 µg/l (vyšší koncentrace, zejména amniová tekutina se ředí 51x). Detekční limit je 1 µg/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 16000 µg/l. Preciznost v sérii je 2,8 – 4,9 %, mezi sériemi 3,6 – 4,7 %. Linearita ředění 97 – 104 %, zpětný výtěžek 97 – 104 %. Při reakci interferuje vysoký RF, antinukleární protilátky a podávané myší monoklonální protilátky.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Inkubace trvá 9 min. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k AFP) přímo úměrný hladině AFP. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,23 – 700 µg/l (po automatickém ředění až do 500000 µg/l). Analytická citlivost je 0,23 µg/l, funkční citlivost 1,2 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 500000 µg/l. Preciznost v sérii 1,0 – 1,9 %, mezi sériemi 3,0 – 4,5 %. Hemoglobin neruší do 5 g/l, bilirubin do 273,6 µmol/l; lipémie při stanovení vadí. Linearita ředění je 90 – 110 %.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Komerčně dostupná je souprava umožňující současně stanovovat AFP i free β-hCG. Mikrotitrační destičky jsou potaženy směsí protilátek proti AFP a free β-hCG. Po pipetování vzorku se přidají protilátky vůči AFP značené Eu³⁺ a  free β-hCG značené Sm³⁺. Po inkubaci (1 h, třepání, laboratorní teplota) následuje promytí, pak se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (Eu³⁺ emise 613 nm, Sm³⁺ emise 643 nm) je přímo úměrná koncentraci analytů ve vzorku a měří se do 1 h. Na základě sedmibodové kalibrace je rozsah metody 1 – 500 µg/l AFP, 1 – 200 µg/l free β-hCG. Analytická senzitivita je pro AFP 0,1 µg/l, pro free β-hCG 0,2 µg/l. Preciznost v sérii AFP 2,9 – 5,7 %; free β-hCG 2,0 – 14,6 %. Preciznost mezi sériemi AFP 3,0 – 4,8 %; free β-hCG 1,9 – 19,3 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči AFP a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální protilátka vůči AFP značená ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 1 – 350 µg/l. Vzorky s koncentrací AFP > 350 µg/l se ředí automaticky 3x (do 1050 µg/l) nebo 101x (do 35350 µg/l), popřípadě manuálně (koncentrace po ředění musí být > 15 µg/l). Preciznost v sérii je 2,7 – 4,6 %, celková preciznost metody je 5,2 – 9,7 % zpětný výtěžek 94,5 – 112,7 %, linearita ředění 89,4 – 102 %. Senzitivita je 0,4 µg/l (2 SD nulového blanku). Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 2 057600 µg/l. Při koncentraci 64000 µg/l nebyl zaznamenán detekovatelný přenos.Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní (sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. AFP se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na purifikovanou polyklonální králičí protilátku značenou esterem akridinu. Následně se přidává monoklonální myší protilátka, která je kovalentně vázaná na paramagnetické částice niklu. Reakce probíhá 7,5 min při teplotě 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci AFP ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě sedmibodové základní kalibrace při použití nových šarží činidel a dvoubodové rekalibrace po dvou nejpozději však čtyřech týdnech. Linearita metody je do 1000 µg/l. Vzorky s koncentrací AFP vyšší než 1000 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Používané manuální nebo automatické ředění je 1:10, 1:20, 1:100 a 1:200. Naměřený výsledek obsluha nebo přístroj násobí 10x, 20x, 100x nebo 200x. Konečná koncentrace AFP ve zředěném roztoku musí být ≥ 15,1 µg/l. Detekční limit metody je 1,3 µg/l. Preciznost v sérii (3,4 µg/l): 2,7 – 4,0 %, mezi sériemi (3,4 µg/l): 2,0 – 4,4 %. Zpětný výtěžek:  91,9 – 109,2 %, linearita ředění: 78,1 – 117,4 %. Efekt nadbytku antigenu se do 1 000000 µg/l neprojevuje. Při metodě neruší: hemoglobin do koncentrace 5 g/l, triacylglyceroly do koncentrace 11,4 mmol/l. Bilirubin do koncentrace 342 µmol/l je negativní interference 5 %. Potenciální interference u metotrexátu dosahovala +6 %.

Jiná chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá myší monoklonální protilátku vůči AFP, zakotvenou na paramagnetických částicích ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči AFP značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci AFP a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky v rozmezí koncentrací 0,4 – 350 µg/l (vyšší koncentrace se ředí manuálně nebo automaticky 16,7x, resp. 166,7). Preciznost v sérii 1,9 – 3,9 %, celkově 2,3 – 4,8 %. Zpětný výtěžek je 100,9 - 104 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového blanku) je 0,4 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1 900000 µg/l. Při koncentraci 91080 µg/l nebyl zaznamenán detekovatelný přenos. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během první inkubace (10 min) AFP a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) druhá monoklonální protilátka značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině AFP. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,4 – 1210 µg/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,4 µg/l. Preciznost v sérii 1,4 – 4,9 %, mezi sériemi 2,9 – 6,7 %. Linearita ředění je 90 – 105 %, zpětný výtěžek 98 – 100 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 859400 µg/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. AFP se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop AFP s polyklonální králičí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci AFP ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 361 µg/l. Vzorky s koncentrací AFP vyšší než 361 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Doporučené ředění je 1 díl vzorku + 9 dílů ředícího roztoku (lze provádět automaticky na analyzátoru nebo manuálně) a naměřený výsledek přístroj nebo obsluha (v manuálním postupu) násobí 10x. Vzorky s extrémně vysokými koncentracemi AFP lze ředit 100x nebo dokonce 1000x univerzálním diluentem. Detekční limit metody: 0,24 µg/l (2 SD), citlivost: 0,24 µg/l (CV ≤ 20 %). Preciznost v sérii (3,4 µg/l): < 3,7 %, mezi sériemi (3,4 µg/l): < 7,2 %. Zpětný výtěžek:  96 - 108 %. Efekt nadbytku antigenu se do 643 000 µg/l neprojevuje. Hemoglobin do koncentrace 1,92  g/l neinterferuje. Bilirubin do koncentrace 342µmol/l vykazuje negativní interferenci 5 %.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje myší monoklonální protilátka vůči AFP značená ALP a standard nebo vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči AFP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah měření při 470 nm na základě sedmibodové kalibrace je 0,5 – 3000 µg/l (po ředění 17x až 51000 µg/l, nebo manuálně 101x až 303000 µg/l). Analytická citlivost (nulový kalibrátor) 0,5 µg/l. Linearita ředění je 101 – 110 %, zpětný výtěžek 101 – 107 %. Preciznost v sérii 2,7 – 3,2 %, celková 3,4 – 4,4 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl prokázán do 500000 µg/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Jako marker lze použít také křenovou peroxidázu a luminiscenčním substrátem je pak luminol. Při sendvičovém stanovení v mikrotitračních destičkách jsou použity myší monoklonální protilátky vůči dvěma různým epitopům AFP. Vzorky a kalibrátory se nejprve inkubují v jamkách potažených první monoklonální protilátkou (1 h, 37 °C, třepání). Po inkubaci se obsah jamek promyje 4x a přidá se do nich konjugát druhé protilátky s křenovou peroxidázou. Po druhé inkubaci (1 h, 37 °C, třepání) se opět jamky 4x promyjí, aby se odstranil nenavázaný konjugát. Přidá se signální činidlo (luminol) a započne peroxidázou katalyzovaná luminiscenční reakce. Emitovaný světelný signál se měří luminometrem mezi 5. a 15. minutou. Koncentrace AFP ve vzorcích je přímo úměrná změřenému světelnému signálu a získá se interpolací z pětibodové kalibrační křivky. Rozsah stanovení je 0,6 – 482 µg/l. Analytická citlivost je 0,6 µg/l, funkční citlivost < 1,2 µg/l. Preciznost v sérii 4,3 %, mezi sériemi 8,1 %. Linearita ředění je 77 – 122 %, zpětný výtěžek 94,6 – 126 %. Koncentrace triacylglycerolů do 11,3 mmol/l stanovení neruší.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči AFP. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči AFP a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-AFP-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci AFP ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je 0,5 – 1000 µg/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 20x). Detekční limit je 0,5 µg/l. Preciznost v sérii 0,1 – 12,7 %, mezi sériemi 0,2 – 17,9 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1 000000 µg/l.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA)v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči AFP a monoklonální myší protilátkou vůči AFP značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci AFP ve vzorku. Chylozita, hemolýza, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,6 – 1210 µg/l (ředění 50x automaticky, ale koncentrace po ředění musí být > 24 µg/l. Detekční limit je 0,61 µg/l. Preciznost v sérii CV 1,4 – 2,4 %, mezi sériemi 2,5 – 3,8 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 1 210000 µg/l. Pokud se použije plazma s citronanem sodným, musí být výsledky korigovány o +10 %.

Standard imunochemických metod je obvykle vztažen na WHO preparát č. 72/225, pak 1 µg/l = 0,83 kIU/l. Při stanovení mohou interferovat HAMA (lidské anti-myší protilátky).

Snížené hodnoty: zpracování neředěného vzorku, triacylglyceroly > 11 mmol/l, alkoholici s jaterní poruchou, těhotné s nízkou hmotností plodu, chybný týden gestace, transplantace ledvin a jiné.

Zvýšené hodnoty: chronický alkoholismus, těhotenství od 10. týdne, dvojčata, kuřačky, chybný týden gestace, hemodialýza a jiné.