pankreatická AMS; alpha-amylase pancreatic;

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Prof. Kodíček uvádí celý název jako jedno slovo, v anglickém názvosloví EC je kmenový základ (např. glucanohydrolase) samostatně.

Stanovení se provádí v séru (vhodnější než plazma), plazmě (heparin, nikoliv heparinát lithný nebo amonný) nebo moči (2 h sběr), ale také v buněčných kulturách, mléku, slinách a stolici. Stabilita 20 až 25 °C 1 – 7 d (sérum, plazma, moč po úpravě na pH 7), 4 až 8 °C 7 – 14 d (sérum, plazma, moč po úpravě na pH 7), -20 °C 8 týdnů – 1 rok (sérum, plazma), resp. 3 týdny (moč po úpravě na pH 7). Moč není doporučeno zamrazovat ani konzervovat. Aktivita v plazmě je vyšší než v séru. Při stanovení v plazmě snižují všechna antikoagulancia (zejména EDTA, oxalát a citran) s výjimkou heparinu aktivitu AMS, protože váží Ca²⁺ ionty, které jsou potřebné pro funkci AMS. Pro analýzu aktivity AMS technologii suchých reagencií lze použít pouze sérum. Fluoridové ionty zvyšují aktivitu AMS. Moč je velmi nestabilní při pH < 7,0. Před skladováním je potřeba upravit pH moče tak, aby bylo mírně alkalické. Zabránit kontaminaci potem a slinami.

Zředění lipemických sér může vyvolat zvýšení aktivity AMS, nebo
e tato séra mohou obsahovat inhibitory, které falešně snižují hodnotu AMS (asi 20 % pacientů s akutní pankreatitidou má hyperlipidémii).

Stanovení neruší hemolýza do koncentrace hemoglobinu 2,5 g/l, vyšší koncentrace způsobují inhibici. Stanovení ovlivňuje lipémie. Aktivitu AMS ovlivňuje podávání léků.

α-Amyláza EC 3.2.1.1 má 2 izoenzymy (pankreatický a slinný) a poločas vymizení pro pankreatický izoenzym je 3 h.

Fotometrie: slinný izoenzym je selektivně inhibován kombinací dvou myších monoklonálních protilátek v preinkubační fázi. Pak následuje reakce pankreatické AMS se substrátem. Substrátem pro stanovení katalytické koncentrace pankreatické AMS je etylidennitrofenylmalto-heptaozid (EPS), jehož koncová skupina je chráněna etylidenovou skupinou. Po hydrolýze vnitřní části řetězce pankreatickou AMS a zbytku řetězce α-glukozidázou (GOD) se z vazby na první glukozyl řetězce uvolní žlutě zbarvený 4-nitrofenol. Přírůstek jeho koncentrace za jednotku času při 410/694 nm je úměrný katalytické koncentraci pankreatické AMS. Linearita metody je do 88,3 µkat/l (některé soupravy jen do 25 µkat/l, jiné až do 125 µkat/l). Při přírůstku absorbance > 0,35 A/min je třeba ředit vzorek fyziologickým roztokem 1+10 a výsledek násobit 11x. Detekční limit 0,05 µkat/l. Preciznost v sérii 0,4 – 0,9 %, mezi sériemi 0,4 – 1,2 %.

Reflexní fotometrie: Po aplikaci na testovací proužek se vzorek dostane do reakční zóny, kde se v případě, že jde o vzorky krve, objeví oddělení erytrocytů od plazmy. Slinná α-amyláza je inhibována 2 monoklonálními protilátkami Pankreatická α-amyláza štěpí substrát indolyl-α,D- maltoheptaosid; α-glukosidáza obsažená v testu vede k tvorbě indoxylu a glukózy. Uvolněný indoxyl kopuluje s 2-metoxy-4-morfolinofenyldiazoniumtetrachlorozinečnatanem a vytváří fialové zbarvení. Množství vytvořeného zabarvení na jednotku je přímo úměrné aktivitě α-amylázy. Aktivita enzymu je měřena kineticky při vlnové délce 567 nm a 37 °C a je zobrazena po 175 s. Stanovení neovlivňují: hematokrit až 55 %, hemoglobin až 6 g/l, bilirubin až 360 µmol/l, triacylglyceroly až 25,9 mmol/l. Rozsah metody 0,23 – 14,17 µkat/l (při vyšších hodnotách ředit 4x fyziologickým roztokem). Preciznost v sérii je 2,3 – 2,6 %, mezi sériemi 4,0 – 4,5 %. Koncentrace kyseliny askorbové nad 100 mg/l vedou k zvýšenému výtěžku. Vysoké koncentrace maltózy > 3 g/l vedou k falešně nízkým výsledkům testu.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou polyklonální protilátkou vůči pankreatické amyláze. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje 2 h při 37 °C. Pak se roztok odsaje a přidá se biotinylovaná polyklonální protilátka vůči pankreatické amyláze. Po inkubaci (1 h, 37 °C) a trojnásobném promytí se přidá konjugát streptavidinu s navázanou křenovou peroxidázou Po inkubaci (1 h, 37 °C) následuje pětinásobné promytí, přidá se chromogen tetrametylbenzidin a reakce (15 – 30 min, 37 °C ve tmě) je zastavena stop činidlem. Měření se provádí do 5 min při 450 nm a absorbance je přímo úměrná aktivitě amylázy. Bichromatická verze s měřením proti 540 nebo 570 nm je správnější. Rozsah měření na základě osmibodové kalibrace je 0,78 – 50 µkat/l. Detekční limit je 0,2 µkat/l. Preciznost v sérii je < 8 %, mezi sériemi < 10 %.

Při stanovení ELISA ve stolici má druhá protilátka přímo navázanou POD a celý proces probíhá za laboratorní teploty. První protilátka (myší monoklonální) je zakotvená v jamkách. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje 1 h (třepání). Po pětinásobném promytí se přidá konjugát myší monoklonální protilátky s navázanou křenovou peroxidázou a inkubuje 1 h (třepání). Po pětinásobné promytí se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce (10 – 20 min) je zastavena stop činidlem. Měření se provádí ihned při 450 nm a absorbance je přímo úměrná aktivitě amylázy. Jestliže byl překročen rozsah absorbance vertikálního fotometru, měří se ihned při 405 nm. Doporučuje se bichromatické měření proti 595, 620, 630, 650 nebo 690 nm. Detekční limit měření je 0,004 µkat/l, rozsah do 0,46 µkat/l (výsledky se násobí x 2000 pro hodnocení aktivity pankreatické amylázy ve stolici).

Toleranční limit EHK (sérum, plazma): 15 %.

Hodnoty snižuje: alkoholismus, fenobarbital, dětský věk. 

Hodnoty zvyšuje: amoxapin, azatioprin, betanechol, cimetidin, cis-platina, diazoxid, dideoxyinosin, felbamát, fentanyl, fenylbutazon, fluoridy, fluvastatin, furosemid, glukokortikoidy, hydantoinové deriváty, hydroflumetiazid, hydrochlorotiazid, chlortalidon, cholinergika, izoniazid, jodid draselný, kodynal, klozapin, kodein, kyselina aminosalicylová, kyselina valproová, meperidin, merkaptopurin, minocyklin, mirtazapin, morfin a další narkotika, pegaspargáza, penicilamin, pentazocin, procyklidin, sulfametoxazol, sulfisoxazol, tiazidy aj.