High-density lipoprotein 2 cholesterol,

HDL2, HDL2-C

Odběr nalačno, vhodná doba lačnění je 12 hodin; večer před plánovaným odběrem krve pacient nejí maso, nepije mléko, neukouří a nepožívá alkohol. Optimální je stabilní dieta po tři týdny. Doporučuje se preferovat stanovení v plazmě před stanovením v séru. Krev se odebírá vsedě (rozdíl mezi hodnotami vsedě a vleže je 6 až 15 %), delší použití manžety je nevhodné. Tříminutová komprese vény může zvýšit koncentraci cholesterolu v krvi o 10 %. Krevní elementy je třeba oddělit do 2 – 3 h od náběru.

Sérum – stabilita vzorku: 20 – 25 °C: 1 – 2 dny, 2 – 8 °C: 2 – 7 dní, -20 °C: 12 týdnů. Plazma – stabilita vzorku: 20 – 25 °C: 1/2 – 2 dny, 2 – 8 °C: 2 – 9 dní, -20 °C: 12 týdnů. Lze použít EDTA. Při teplotě < -50 °C je vzorek stabilní alespoň 2 roky. Mrazení a rozmrazení vzorku je možné jen jednou a po rozmrazení je třeba vzorek jemně promíchat.

Výsledek ovlivňuje fyzická zátěž, alkohol a léky. Stanovení má významný intraindividuální rozptyl, proto je nutné ho před diagnostickými závěry opakovat. Stanovení neruší triacylglyceroly < 10,2 mmol/l, hemoglobin < 2 g/l a bilirubin < 171 µmol/l.

HDL lze rozdělit ultracentrifugací s gradientem hustoty nebo elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s gradientem hustoty na dvě základní skupiny: HDL₂ a HDL₃. Heterogenita HDL se projevuje také při chromatografiích nebo izoelektrické fokusaci.

Přímé postupy stanovení pomocí analytické ultracentrifugace (referenční metoda) nebo izolací HDL (chromatografie na koloně, elektroforéza, preparativní ultracentrifugace nebo polyaniontová precipitační technika) s následným gravimetrickým stanovením jsou časově a i finančně náročné.

Dalším postupem je rozdělení ve vertikálním centrifugačním gradientu, kde rozlišitelnost absorpčních křivek HDL2 a HDL3 lze zlepšit pomocí matematických modelů. Centrifugace 80000 ot/min, 10 °C, 90 min. Preciznost pro HDL3 v sérii 1,2 – 4,6 %, mezi sériemi 2,3 – 4,4 %; pro HDL2 v sérii 2,2 – 13, 0 %, mezi sériemi 4,7 – 16,4 %.

Elektroforéza na polyakrylamidovém diskovém gelu koreluje poměrně dobře s ultracentrifugací. Také se používá gradientová elektroforéza polyakrylamid-agaróza (gradient 4 – 30 %).  

HDL2 lze stanovit také kapilární elektroforézou nebo NMR.

Homogenní analýza má dva kroky. V prvním kroku se lipoproteiny bohaté na TAG a LDL rozkládají sfingomyelinázou a cholesterol uvolněný z těchto lipoproteinů poskytuje za katalýzy cholesteroloxidázou a cholesterolesterázou peroxid vodíku. H₂O₂ se rozkládá katalázou na vodu a vzniká bezbarvý produkt. Mezi zbylými lipoproteiny (HDL2 a HDL3) pak již reaguje s polyoxyetylenstyrenovaným derivátem fenyléteru jen HDL3 za vzniku H₂O₂ (cholesteroloxidázou). H₂O₂ pak následnou Trinderovou reakcí s POD poskytuje nachově-červený produkt, který se měří při 600 nm. (HDL2 lze dopočítat). Celková preciznost metody je < 2 %. Reakci neruší hemoglobin 5 g/l ani bilirubin 510 µmol/l.

Metoda dvojí precipitace používá heparin a MnCl₂ k vysrážení VLDL a LDL frakcí. V supernatantu se pak vysráží HDL2 dextransulfátem. Precipitát HDL2 se pak stanoví jako celkový cholesterol.

Metoda dvojí precipitace používá dextransulfát s hořečnatými ionty. Podle množství MgCl₂ se precipituje celý podíl HDL nebo HDL mimo frakci HDL3, která se pak stanoví v supernatantu (jako celkový cholesterol). Odečtením HDL3 od celkové HDL lze stanovit HDL2. Celková preciznost metody je 1,4 – 2,4 %.

HPLC začíná precipitací HDL frakcí fosfowolframovou kyselinou v přítomnosti hořečnatých iontů. HDL frakce se ředí fyziologickým roztokem a k separaci se používá gelová permeační chromatografie na sloupci oxidu křemičitého (600x7,5 mm). Subfrakce HDL2 a HDL3 byly monitorovány UV detektorem při 280 nm.

Koncentraci HDL2 cholesterolu snižují: AIDS, diabetes mellitus, dlouhodobá fyzická inaktivita, hemodialýza, hypertyreóza, kouření, malnutrice, obezita, srdeční ischémie, urémie; léky: anabolika, beta-blokátory, cyproteron, danazol, diuretika, estrogen/progesteronová terapie, etretinát, fenotiaziny, furosemid, chlorpropamid, chlortalidon, interferon, interleukin, kortikoidy, kyselina chendeoxycholová, lynestrenol, metyldopa, metoprolol, nadolol, norgestrel, oxprenolol, probukol, progestiny, propranolol, ranitidin, sotalol, spironolakton, stanozolol, tiazidy.

Koncentraci HDL2 cholesterolu zvyšují: alkoholismus, dlouhodobá fyzická vytrvalostní zátěž, gravidita; léky: antiepileptika, celiprolol, estradiol, etanol, etinylestradiol, gemfibrozil, glutetimid, hydrochlorotiazid, ILGF-I, indapamid, intralipid, inzulin, kaprazidil, kyselina askorbová, kyselina nikotinová, omega-3-mastné kyseliny, mepindolol, nizoldipin, pindolol, salbutamol.