volné mastné kyseliny

non-esterified fatty acids, free fatty acids, NEFA, FFA

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA, oxalát nebo citrát). Odběr se provádí ráno na lačno. Nevhodné jsou vzorky při aplikaci heparinu. Separaci séra provést do 2 h po koagulaci. Sérum není stabilní při laboratorní teplotě, při 4 – 8 °C 24 h, při -28 °C 1 měsíc.

Fotometrie se používá k detekci barevných produktů FFA. Neesterifikované mastné kyseliny v séru reagují s acyl-CoA syntetázou v přítomnosti adenosintrifosfátu a CoA tioesterů CoA, známých jako acyl-CoA spolu s vedlejšími produkty adenosinmonofosfátem a pyrofosfátem. V dalším kroku se acyl-CoA oxiduje přidanou acyl-CoA oxidázou a vzniká peroxid vodíku. H₂O₂ v přítomnosti peroxidázy Trinderovou reakcí s 3-metyl-N-etyl-N-(β-hydroxyetyl)-anilinem a 4-aminoantipyrinem poskytuje modro-purpurový adukt, který se při 560/670 nm detekuje fotometricky. Při měření se používá šestibodová kalibrace (dvoubodová kinetika 576 a 608 s). Rozsah měření 0,01 – 4 mmol/l (vzorky s vyšší koncentrací se ředí 3x fyziologickým roztokem). Mez detekce je 0,0014 mmol/l. zpětný výtěžek je 96,6 – 105,1 %. Přesnost v sérii 0,6 – 0,8 %, celkem 0,8 – 5,0 %. Při reakci neruší hemoglobin 5 g/l a bilirubin 684 µmol/l.

Fluorimetrie se může použít k detekci stejné reakce (excitace 535 nm, emise 587 nm), reakce je ale 10x citlivější.

ELISA používá mikrotitrační destičky se zakotvenou myší monoklonální protilátkou vůči FFA. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek a ihned druhá polyklonální protilátka vůči FFA označená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (60 min, 37 °C) se odsaje roztok, jamky se 5x promyjí. Pak se přidá tetrametylbenzidin (inkubace 10 – 15 min, 37 °C ve tmě) a následně stop činidlo. Měření se provádí ihned při 450 nm na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 1 – 1000 ng/l. Analytická citlivost je 1 ng/l. Preciznost v sérii < 9 %, mezi sériemi < 10 %; linearita ředění 92 – 108 %, zpětný výtěžek 94 – 103 %. Silně hemolytické a lipemické vzorky nejsou vhodné pro analýzu. Tento postup je extrémně citlivý a hodí se jen pro vědecké studie.

Chromatografické metody stanovují jednotlivé neesterifikované mastné kyseliny separátně.

Plynová chromatografie používá pro náplň kolony modifikovaný polyetylenglykol s kyselými funkčními skupinami. Tím je možný i přímý nástřik karboxylových kyselin. Mobilní fází je hélium. Pec se vyhřívá v gradientu 10 °C/min od 100 do 220 °C. K detekci se používá plameno-ionizační detektor. Stanovují se vzorky v rozmezí 50 – 800 mg/l. Metoda není dost citlivá.

GC-MS vyžaduje úpravu FFA. Napřed dochází k reakci s kyselým fluoridem bis(2-metoxyetyl)amino-S trifluorid a potom k převedení na diamid (působí diizopropyletylamin a dimetylamin). Derivatizace probíhá v dichlormetanu při 0 °C. Pro chromatografii se používá nepolární kapilární kolona (30 m x 0,18 mm) a hélium jako nosný plyn. Výchozí teplota pece je 130 °C s gradientem 50 °C do 270 °C. Koncová teplota je 290 °C. Iontový zdroj MS má teplotu 200 °C (elektronová energie 70 eV) Spektra jsou snímána v intervalu m/z 50 – 500. Jako vnitřní standard se používá kyselina margarová (C17). Linearita měření je v rozsahu 1 – 20 mg/l. Preciznost v sérii 1,4 – 5,1 %. Zpětný výtěžek je 90 %.

HPLC lze provádět na koloně 150x4,6 mm, s velikostí zrna 3 µm (Supelcosil LC-8). Mobilní fází je acetonitril-tetrahydrofuran s 0,1 % H₃PO₄ (50,4:21,6:28), průtok 1 ml/min. Teplota kolony 35 °C, UV detekce při 215 nm.

LC-MS využívá obohacení vzorku o kyselinu palmitovou značenou ¹³C. Po extrakci (izopropylalkohol+heptan+H₂SO₄ 40+10+1) lze provést přímý nástřik vzorku a detekci ionizací s elektrosprejí. Kolona C18 (velikost zrna 2,7 µm) 150x2,1 mm, mobilní fáze: acetonitril-octan amonný (s gradientem) 0,4 ml/min. Elektrosprej 5500 V vyhříván na 60 °C. Jako negativní ionty byly detekovány palmitát m/z 257 [M+2-H]^- a [¹³C₁₆]palmitát m/z 271[M+16-H]^-. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0 – 400 µmol kyseliny palmitové.

Hodnoty snižuje: odběr do heparinu, pozdní separace séra (plazmy), acetoacetát, cvičení, rybí tuk, parenterální výživa, cystická fibróza; léky: acebutolol, asparagináza, atenolol, beta-blokátory, fenformin, glukóza, inzulin, klofibrát, kyselina acetylsalicylová, kyselina nikotinová, fototerapie, metoprolol, neomycin, niacin, oxprenolol, propranolol, salicyláty, streptozocin. Také EDTA a oxalát mohou snižovat hodnoty.

Hodnoty zvyšuje: hladovění, stres, lipolytické přípravky, alkoholismus, jaterní encefalopatie, hypertyreóza, akutní infarkt myokardu, Gierkeho nemoc, obezita, Reyův syndrom, kouření, hypotermie, po jídle a fyzické zátěži, krevní tlak, intralipid, těhotenství, nadměrné uvolňování: ACTH, adrenalinu, glukagonu, noradrenalinu, TSH; léky: amfetamin, aminofylin, desipramin, diazoxid, fenformin, glukóza, heparin, růstový hormon, chlorpromazin, izoproterenol, katecholaminy, karbutamid, kofein, kyselina valproová, levodopa, lysergid, nikotin, perorální kontraceptiva, prazosin, reserpin, teofylin, tolbutamid, tyroxin.