HAV IgG, HAV IgG antibodies, HAVAB IgG, HAVAb IgG

Stanovení se provádí v séru (plazmě). Maximální čas od získání do zpracování vzorku je 1 d při doporučené teplotě 4°C. Sérum je stabilní při 18 – 26 °C 4 – 24 h, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců.

Pokud nebude uvedeno jinak, jsou všechny typy souprav pouze pro kvalitativní stanovení.

Všechny soupravy s výjimkou jediné (chemiluminiscence s akridiniumkarboxamidem) stanovují anti-HAV IgG+IgM (anti-HAV total).

RIA analýza se používá již omezeně, i když stále existují komerční soupravy na trhu. Obvykle se sleduje kompetitivní reakce mezi anti-HAV ze séra a anti-HAV značenými ¹²⁵I o vazebná místa na viru hepatitidy A, který je vázaný na stěně zkumavky. Radioaktivita je po vymytí nepřímo úměrná množství anti-HAV (IgG+IgM) v séru (existuje také souprava pouze pro anti-HAV IgG).

ELISA (kompetitivní princip) používá mikrotitrační destičky se zakotvenou lidskou protilátkou vůči HAV. Pipetuje se kalibrátor nebo vzorek. Pak se přidá HAV (z lidských fibroplastů) a myší monoklonální protilátka vůči HAV označená křenovou peroxidázou (konjugát se váže na jiné místo HAV než volná protilátka). Imunoreakce (soutěž o volná místa HAV) se provádí 120 min při 37 °C, roztok se odsaje a jamky 4x promyjí. Dále se přidává tetrametylbenzidin (inkubace 30 min ve tmě při 18 – 25 °C) a následně stop činidlo (1 M H₂SO₄). Měření se provádí při 450/615-690 nm do 60 min a signál je nepřímo úměrný koncentraci anti-HAV (IgG+IgM). Vzorky s absorbancí cut-off + 10 % jsou negativní, s absorbancí cut-off -10 % pozitivní a mezi těmito hodnotami hraniční. Lze provést také kvantitativní hodnocení na základě standardů 10, 20, 40 a 80 U/l (koncentrace > 60 U/l se ředí dle potřeby 10x, 100x nebo 1000x. Preciznost v sérii 3,6 – 9,4 %, mezi sériemi 7,8 – 16,6 %. Hemolýza, lipémie a ikterus neruší. Relativní senzitivita je 98,5 %, relativní specificita 96,6 %. Antikoagulancia (heparin, EDTA, citrát) stanovení neovlivňují.

Jiný postup ELISA má zakotvenou myší monoklonální protilátku vůči HAV a je dvoukrokový. Po kompetitivní reakci o HAV (120 min, 37 °C) následuje promytí 5x a navázání konjugátu myší monoklonální protilátky s křenovou peroxidázou (60 min, 37 °C). Další postup je stejný jako v předchozím případě. Lze provést také kvantitativní hodnocení na základě standardů 5, 10, 20, 40 a 80 U/l (koncentrace > 60 U/l se ředí dle potřeby 10x, 100x nebo 1000x.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené lidským virem hepatitidy A. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu. Přidá se konjugát lidských protilátek vůči HAV značený ALP v pufru TRIS, který obsadí volná místa HAV. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je nepřímo úměrná anti-HAV (IgG+IgM). Jednobodová kalibrace (v dubletu) slouží pro kvalitativní hodnocení. Cut-off odpovídá 50 % průměrné reakční rychlosti kalibrátoru (nižší hodnoty než cut-off mají reaktivní vzorky). Preciznost v sérii je 3,6 – 4,3 %, mezi sériemi 4,4 – 5,0 %. Relativní senzitivita je 98,5 %, relativní specificita 97,3 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá lidský virus hepatitidy A zakotvený na paramagnetických částicích, ke kterému se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči lidskému IgG značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině anti-HAV IgG a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Jednobodová kalibrace (v tripletu) slouží pro kvalitativní hodnocení. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) ≥ 1,00 jsou reaktivní na anti-HAV IgG (je to jediný postup výhradně pro anti-HAV IgG!). Preciznost v sérii je 5,87 – 16,12 %, mezi sériemi 6,23 – 16,12 %. Relativní senzitivita je 98,0 %, relativní specificita 97,6 %. Silná hemolýza ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Podobný princip zábleskové luminiscence, ale v kompetitivním uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku se pipetuje pomocné činidlo (cystein v citrátovém pufru). Po inkubaci 4 min při 37 °C se přidá HAV v tricinovém pufru. Po druhé inkubaci 26,6 min při 37 °C se přidá monoklonální myší protilátka vůči HAV značená esterem akridinu, monoklonální myší anti-HAV Fab fragment a paramagnetické latexové částice potažené streptavidinem. Při třetí inkubaci (16,6 min při 37 °C) se na částice připojí imunokomplex. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je nepřímo úměrná množství anti-HAV IgG+IgM) fotonásobičem při 429 nm. Provádí se dvoubodová kalibrace. Vzorky s hodnotami anti-HAV IgG+IgM > 20 U/l se ředí 20x nebo 200x dle potřeby pro kvantitativní hodnocení. Pro kvalitativní hodnocení se vzorky s koncentrací anti-HAV IgG+IgM < 20 U/l považují za nereaktivní, ≥ 20 U/l jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 1,3 – 7,1 %, mezi sériemi 2,6 – 12,7 %. Relativní senzitivita je 98,2 %, relativní specificita 93,7 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují < 10 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další kompetitivní dvojstupňový zábleskový postup, kdy anti-HAV (IgG+IgM) ze vzorku se naváže během první inkubace (10 min) na lidský HAV. Pak se přidají magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči HAV (vážou se na jiný epitop HAV) a monoklonální myší protilátka vůči HAV značená izoluminolem (soutěží se stanovovanými protilátkami IgG+IgM) a proběhne další inkubace (20 min). Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je nepřímo úměrná hladině anti-HAV IgG+IgM. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku. Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / cut-off) ≥ 1,1 jsou nereaktivní na anti-HAV IgG+IgM, < 0,9 jsou reaktivní, 0,9 – 1,1 jsou reaktivní v šedé zóně (vyšetření opakovat v týdenních intervalech). Preciznost v sérii 2,3 – 8,7 %, mezi sériemi 6,8 – 23,2 %. Analytická citlivost 18 U/l. Relativní senzitivita je 97,1 %, relativní specificita 98,8 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Jiné stanovení je založeno na kompetitivní imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči HAV ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin soutěží s polyklonální králičí anti-HAV imobilizovanou na polystyrénové kuličce o vazebná místa na HAV; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na druhé vazebné místo HAV naváže polyklonální králičí protilátka vůči HAV konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-HAV IgG+IgM ve vyšetřovaném vzorku. Používá se indexový kalibrátor. Vzorky s indexem < 0,9 jsou nereaktivní, 0,9 až < 1,1 jsou neurčité, ≥ 1,1 jsou reaktivní. Pozor, kalibrátor je v tomto případě neobvykle v čitateli zlomku! Preciznost v sérii je 2,5 – 6,1 %, celková 5,7 – 17,7 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 90,9 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 5,4 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530 v dvoustupňové sekvenční reakci. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující anti-HAV a přidá se HAV. Po inkubaci se přidají paramagnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči HAV (naváže se na zbylá volná místa na HAV) a monoklonální myší protilátka vůči HAV značená ALP (naváže se na jiný epitop HAV). Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je nepřímo úměrné množství anti-HAV IgG+IgM. Doba analýzy činí 50 min. Rozsah měření při 470 nm na základě pětibodové kalibrace je 0 – 80 U/l (vyšší koncentrace protilátek vyžadují ředění 10x, 100x nebo 1000x). Souprava slouží zejména pro kvantitativní stanovení. Pro kvalitativní hodnocení jsou výsledky < 35 U/l nereaktivní, 35 až < 40 U/l jsou neurčité, ≥ 40 U/l jsou reaktivní. Preciznost má CV < 10 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 99,8 %. Vysoké koncentrace hemoglobinu (20 g/l), bilirubinu (342 µmol/l) a triacylglycerolů (40,7 mmol/l) neruší při analýze. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sekvenčním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (50 µl) je inkubován s lidským HAV. Pak se přidá biotinylovaná myší monoklonální protilátka vůči HAV (IgG+IgM), monoklonální myší anti-HAV (IgG+IgM) značený ruthéniovým komplexem (váže se na jiný epitop HAV) a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je nepřímo úměrná hladině anti HVA IgG+IgM ve vzorku. Metoda je použitelná kvantitativně v rozsahu 3 – 60 U/l. Ředění při vyšších koncentracích je nutné provádět tak, aby koncentrace po ředění byla > 20 U/l. Pro kvalitativní hodnocení jsou výsledky < 20 U/l anti-HAV IgG+IgM nereaktivní, ≥ 20 U/l jsou reaktivní. Preciznost v sérii 0,5 – 2,3 %, mezi sériemi 1,6 – 4,0 %. Relativní specificita je 98,1 %. Hemolýza (hemoglobin 12 g/l), chylozita (triacylglyceroly 11,3 mmol/l), ikterus (bilirubin 855 µmol/l) a RF (< 1600 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Falešná negativita: snížení tvorby protilátek zvláště u dětí, pozdní stanovení (3 – 6 měsíců po infekci).

Falešná pozitivita: vysoké koncentrace revmatoidního faktoru, v souvislosti s jaterními enzymy.