PRL, prolactin, laktotropní hormon, LTH, laktotropin

Odběr krve mezi 8 – 10 h ranní (nejdříve 1 – 2 h po probuzení) do ledové tříště. Nutno vyloučit stres. Při podezření na hypersekreci je doporučen trojí odběr po 20 min, nebo po 3 dny ve stejnou raní dobu. Je třeba vyloučit hemolytické vzorky. Analyt je stabilní v celé krvi 7 d při 15 – 25 °C, v séru při 20 – 25 °C 1d, 1 – 7d při 4 °C, 1 měsíc – 5 let při -20 °C. Kromě séra lze použít i plazmu (antikoagulans jen heparin). Opakované zamrazení se nedoporučuje.

Výsledky mezi jednotlivými metodami se liší zejména, protože prolaktin se vyskytuje ve třech konfiguracích: monomer (23000 – 25000), dimer (50000 – 60000) a nekovalentně vázané agregáty (> 100000) v zastoupení 75:20:5.

RIA v kompetitivním uspořádání, kdy v prvním kroku soutěží prolaktin ze vzorku s prolaktinem značeným ¹²⁵I o vazebná místa na specifické protilátce (16 – 24 h za laboratorní teploty) a v následné inkubaci (10 min) se přidají magnetické polymerní částice potažené oslím (anti-ovčím) sérem. Po magnetické separaci se aktivita změří gama-počítačem (1 min). I když analytické parametry metody jsou vyhovující, je postup v současnosti příliš pomalý.

IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou (nebo kozí polyklonální) vůči prolaktinu a přidáním druhé (myší monoklonální) protilátky vůči prolaktinu značené ¹²⁵I. Po inkubaci (60 min nebo 120 min, laboratorní teplota, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 10,6 (2,1) – 3816 (4240) mU/l; analytická citlivost 10,6 (2,1) mU/l, funkční citlivost 13,8 mU/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 318000 mU/l. Preciznost v sérii je ≤ 7,09 %, mezi sériemi ≤ 10,11 %. Linearita ředění 88,6 – 117 %, zpětný výtěžek 81 – 107 %.

ELISA používá dvou monoklonálních myších protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou a druhá je zakotvená v jamkách mikrotitrační destičky. Do mikrotitrační destičky se pipetuje vzorek a přidá se konjugát s peroxidázou. Po inkubaci 1 h a trojnásobném propláchnutí se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 15 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (1 M H₂SO₄) a měří se při 450 nm do 20 min, kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci prolaktinu. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 10 – 3200 (jiná souprava 4240) mU/l (ředění nulovým kalibrátorem 8x). Mez detekce je 10 mU/l. Preciznost v sérii je 6,9 – 11,6 %, mezi sériemi 7,6 – 14,4 %. Zpětný výtěžek 84,9 – 123,2 %, linearita ředění 86 – 109 %. Silná hemolýza, lipémie a ikterus ruší analýzu. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči prolaktinu. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se králičí polyklonální protilátka vůči prolaktinu značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 12,7 – 4240 mU/l. (Vzorky s hodnotami prolaktinu > 4240 mU/l lze manuálně ředit nulovým kalibrátorem; hodnota po ředění musí být > 12,7 mU/l). Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 212000 mU/l. Preciznost v sérii je 2,81 – 4,13 %, celková preciznost metody je 3,43 – 6,29 %. Zpětný výtěžek 97 – 106 %. Analytická senzitivita je 12,7 mU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita: růstový hormon 1,71 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Sendvičová reakce probíhá 19 min mezi prolaktinem ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči prolaktinu značenou Eu³⁺ a monoklonální protilátkou vůči prolaktinu, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k prolaktinu) přímo úměrný hladině prolaktinu. Rozsah měření je 5 – 4600 mU/l (po automatickém ředění až do 1000000 mU/l). Kalibrace je pouze jednobodová. Analytická citlivost je 5 mU/l. Preciznost v sérii 0,6 – 3,5 %, mezi sériemi 2,1 – 3,7 %. Linearita ředění je 91 – 104 %.  Neruší hemoglobin < 7,5 g/l, triacylglyceroly < 9 mmol/l, bilirubin < 684 µmol/l. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 753000 mU/l.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena protilátka vůči prolaktinu. V sendvičovém uspořádání se pipetuje prolaktin ze vzorku a specifická protilátka značená Eu³⁺. Po inkubaci (90 min třepání) a promytí se přidá zesilovací roztok; reakční směs se třepe 5 min a celý postup probíhá za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci prolaktinu ve vzorku a měří se do 1 h. Analytická citlivost je 1,44 mU/l. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace 1,44 – 5300 mU/l.

AlphaLISA je postup, kdy se do mikrotitrační destičky pipetuje vzorek, pak se přidá akceptorová kulička potažena protilátkou vůči prolaktinu a druhá volná protilátka vůči prolaktinu s biotinylovou kotvou. Proběhne inkubace 60 min při 23 °C. Přidá se donorová kulička potažena streptavidinem a proběhne druhá inkubace 30 min při 23 °C ve tmě. Takto vznikne komplex, kde donorová kulička po ozáření 680 nm uvolní singletový kyslík, který vyvolá fluorescenci akceptorové kuličky 615 nm. Rozsah měření do 6360 mU/l, analytická citlivost 2,6 mU/l. Preciznost v sérii 5,2 – 9,6 %, mezi sériemi 6,7 – 14,0 %; zpětný výtěžek 82 – 107 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči prolaktinu zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči prolaktinu značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině prolaktinu a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 12,7 – 4240 mU/l (Vzorky s hodnotami prolaktinu > 4240 mU/l lze ředit automaticky 10x nebo manuálně 40x; po ředění musí být hodnota > 106 mU/l). Preciznost v sérii je 2,3 – 3,8 %, celkově 3,3 – 4,7 %. Zpětný výtěžek 92,4 – 101,1 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) 12,7 mU/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku pacientského séra se přidá polyklonální kozí protilátka vůči prolaktinu značená esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidá monoklonální myší protilátka vůči prolaktinu kovalentně vázaná na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 6,4 – 4240 mU/l. Vzorky s hladinou prolaktinu > 4240 mU/l se ředí automaticky 2x nebo 5x (ještě více manuálně). Analytická citlivost je 6,4 mU/l. Preciznost v sérii 1,9 – 4,4 %, mezi sériemi 2,0 – 5,3 %. Linearita ředění je 88,9 – 107,8 %, zpětný výtěžek 93,6 – 109,3 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Efekt nadbytku antigenu se při měření může projevit kolem 848000 mU/l.

CLIA je další jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže prolaktin a současně se na jeho další epitop připojí druhá myší monoklonální protilátka vůči prolaktinu značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině prolaktinu. Rozsah měření na základě dvoubodové kalibrace je 2 – 8000 mU/l. Analytická citlivost je 2 mU/l, funkční citlivost 4 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 700000 mU/l. Preciznost v sérii je 2,2 – 3,2 %, mezi sériemi 2,9 – 6,4 %. Linearita ředění je 101 – 106 %, zpětný výtěžek 97 – 101 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Prolaktin se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči prolaktinu imobilizovanou na polystyrénové kuličce a současně se na druhé vazebné místo prolaktinu naváže polyklonální kozí protilátka vůči prolaktinu konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině prolaktinu ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 3180 mU/l (při vyšších koncentracích se ředí diluentem), avšak do hodnoty 466400 mU/l nebyl pozorován efekt nadbytku antigenu. Analytická citlivost je 11 mU/l. Preciznost v sérii 5,7 – 6,8 %, mezi sériemi 6,4 – 9,6 %; zpětný výtěžek 97 – 121 %, linearita ředění 86 – 119 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující prolaktin a paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší protilátkou vůči prolaktinu. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se druhá kozí protilátkou vůči prolaktinu značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství prolaktinu. Reagencie se musí skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 5,3 – 4240 mU/l. (po ředění 10x nulovým kalibrátorem až do 42400 mU/l). Analytická citlivost 5,3 mU/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 636000 mU/l. Preciznost v sérii je 1,54 – 1,61 %, celková 3,32 – 6,92 %. Linearita ředění 97 – 111 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy prolaktin ze vzorku se váže současně na ovčí biotinylovanou protilátku vůči prolaktinu a myší monoklonální protilátka vůči prolaktinu značenou křenovou peroxidázou. Imunokomplex se zakotví v jamce potažené streptavidinem. Po inkubaci (16 min, 37 °C, třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvojbodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci prolaktinu ve vzorku a odečítá se mezi 5. a 15. min. Rozsah měření 30,8 – 7000 mU/l (ředění vyšších hodnot automaticky 10x). Analytická senzitivita 10,7 mU/l, funkční senzitivita 30,8 mU/l. Preciznost v sérii 0,5 – 5,8 %, mezi sériemi je 1,6 – 8,7 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Hladiny biotinu zůstávají zvýšené do 24 h od podání.

Alternativní postup v sekvenčním provedení má myší protilátku přímo zakotvenou v jamce a inkubace se vzorkem trvá 30 min; po čtyřnásobném promytí se přidá konjugát druhé protilátky s POD a reakční směs je inkubována 30 min. Po čtyřnásobném promytí se do jamky přidává signální činidlo a odečítá se mezi 5. a 15. min. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace je 6 – 5000 mU/l.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči prolaktinu. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči prolaktinu a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-prolaktin-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný hladině prolaktinu ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je na základě pětibodové kalibrace 4,24 – 5300 mU/l (automatické ředění 4x, manuálně lze ředit i více). Analytická citlivost je 4,24 mU/l. Preciznost v sérii 1,4 – 2,9 %, mezi sériemi 1,8 – 4,7 %. Zpětný výtěžek je 98 – 110 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 1060000 mU/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči prolaktinu. Pak se přidají monoklonální myší protilátka vůči prolaktinu značená ruthéniovým komplexem a paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině prolaktinu ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 1 – 10000 mU/l. Ředění při vyšších koncentracích 10x (koncentrace ředěného vzorku musí být > 50 mU/l. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 1 mU/l. Preciznost v sérii 0,8 – 4,0 %, mezi sériemi 1,4 – 5,0 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 1100 kU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 270000 mU/l. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Některé laboratoře vyjadřují koncentrace v µg/l (1 µg/l = 21,2 mU/l).

K dispozici jsou mezinárodní standardy WHO IS 83/562 a IS 84/500.

Toleranční limit EHK: do 110 mU/l 17,6 mU/l; při vyšších hodnotách 16 %.

Hodnoty snižuje: věk po 50. roce, menopausa, alkohol (60 min po požití), hladovění (1 týden), nízkotučná dieta, malnutrice, bulimie, hypotermie, bilirubin, tělesný stres, kouření (pokles až 20 %), vegetariánství; léky: apomorfin, bromokriptin (Parlodel), L-dopa, cyklosporin, kalcitonin, klonidin, kyselina valproová, námelové alkaloidy, propranolol, rifampicin, tamoxifen.

Hodnoty zvyšuje: akromegalie, amenorea, anorexie, galaktorea, těhotenství, puberta (vzestup o 50 %), laktace, jídlo, psychologický stres, pohlavní styk, dráždění bradavek, tepelný stres, menstruace, hypoglykémie, spánek (hodnoty zvýšené 2-3x); léky: α-metyldopa, amitriptylin, amfetaminy, antiepileptika, antihistaminika, antiemetika, antidepresiva, antihypertenziva, antipsychotika, arginin, benzerazid, butyrofenony, cimetidin, D-fenfluramin, desipramin, domperidon, enfluran, estrogeny, fenothiazin, fentanyl, flufenazin, flunarizin, furosemid, haloperidol, chlorpromazin, imipramin, inhibitory MAO, interleukin-2, inzulin, klomipramin, labetalol, metadon, metoklopramid, neuroleptika, opiáty, perorální kontraceptiva, perfenazin, pimozid, prochlorperazin, promazin, ranitidin, reserpin, růstový hormon, sulpirid, thioridazin, thiotixen, thioxantiny, tryptofan, verapamil, zimeldin.

Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost heterofilních protilátek.

Makroprolaktin poskytuje falešně vyšší výsledky.