mycoplasmal pneumonia, Eaton agent titer

Odebírá se srážlivá krev ráno nalačno. Následný odběr je po 10 – 14 d.  Sérum je při laboratorní teplotě stabilní 2d, při 4 – 8 °C 14 d, při -20 °C 1 rok.

Komplement fixační reakce se nedoporučuje, protože je značně nespecifická.

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči Mycoplasma pneumoniae v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Mycoplasma pneumoniae. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgM a IgA) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům Mycoplasma pneumoniae. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru (index = 1) tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 5,3 – 9,0 %, mezi sériemi 3,4 – 6,9 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

ELISA IgM umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči Mycoplasma pneumoniae v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Mycoplasma pneumoniae. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgG a IgA) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgM značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek proti antigenům Mycoplasma pneumoniae. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru (index = 1) tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 2,9 – 9,2 %, mezi sériemi 4,8 – 7,8 %. Senzitivita: 94,4 %, specifita: 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

Jako značku lze při ELISA použít také ALP (konjugovanou s myší monoklonální protilátkou vůči lidskému IgM) a substrátem je 5-brom-4-chlor-O-3-indolyl fosfát. Na reakční kartu se aplikují do dvou jamek pro vzorek 2 kapky séra a inkubují 2 min při 22 – 25 °C. Pak se přidají 3 kapky konjugátu a opět se inkubuje 2 min při 22 – 25 °C. Do dvou reakčních jamek se přidají 3 kapky pufru (guanidin hydrochlorid) a počká se, až se absorbuje. Pak se přidají do reakčních jamek 2 kapky substrátu a přesně po 5 min se odečítají vizuálně výsledky. Pozitivní reakce je při modrém zbarvení obou reakčních políček do modra. Jestliže je modře zbarveno jen kontrolní políčko (obsahuje IgM protilátku Mycoplasma pneumoniae) hodnotí se výsledek jako negativní. Senzitivita: 82 – 94 %, specifita: 87 - 93 %.      

ELISA IgA umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgA vůči Mycoplasma pneumoniae v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem Mycoplasma pneumoniae. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgA protilátky (také IgG a IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgA značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgA protilátek proti antigenům. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru (index = 1) tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 3,5 – 6,1 %, mezi sériemi 3,9 – 8,1 %. Senzitivita: > 90 %, specifita: > 90 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

Nepřímá imunofluorescence IgG Do jamek destiček s ukotveným antigenem Mycoplasma pneumoniae byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 30 min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s protilátkou vůči lidskému IgG. Následovala další inkubace 30 min při 20 – 25 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky bez fluorescence jsou negativní, s titrem 1:64 nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) na 1+ jsou nejasné a s titrem 1:128 a fluorescencí > 1 jsou pozitivní. Senzitivita: 89 %, specifita: 95 %. Lipemické vzorky nejsou vhodné.

Nepřímá imunofluorescence IgM Pro průkaz IgM protilátek je třeba sérum upravit reakcí se sorbentem (kozí protilátkou vůči lidskému IgG). Do jamek destiček s ukotveným antigenem Mycoplasma pneumoniae (kmen FH) byla pipetována analyzovaná séra (naředěná fosfátovým pufrem). Po inkubaci 90 min při 37 °C vypláchnutí a promývání fosfátovým pufrem (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s protilátkou vůči lidskému IgM. Následovala další inkubace 30 min při 37 °C. Pak byly vzorky promyty (2x), vysušeny a překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Reakce je pozitivní, když se objeví intenzivní zelená fluorescence na červeném pozadí buněk a negativní, když vidíme jen červené pozadí buněk. Senzitivita: 96,8 %, specifita: 100 %.

Falešná negativita se objevuje, je-li test proveden příliš brzo, nebo je pacient imunorezistentní.

Falešná pozitivita se může objevit při detekování protilátek z předchozí infekce, zvláště u pacientů starších 40 let. Komplement fixační reakce vykazuje křížovou reaktivitu s dalšími bakteriemi. Falešná pozitivita může být i vlivem autoprotilátek.