HSV Antibodies IgM, Herpes Simplex Virus (HSV) Type 1 and Type 2 Specific Antibodies IgM, HSV Ab IgM

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: EDTA, heparin nebo citrát). Stabilita v séru za laboratorní teploty 8 h, při 4 – 8 °C 3 – 5 d, při -20 °C 6 měsíců.

Fixace komplementu je semikvantitativní test, při kterém řada malých bílkovin reaguje s komplexem antigenu HSV a jeho protilátek. Napřed se tepelně denaturuje komplement séra a přidá se standardní množství morčecího komplementu. Dále se přidá HSV. Pokud nejsou přítomné protilátky vůči tomuto viru, dochází k lýze přidaných ovčích erytrocytů komplementem a vzniká růžové zbarvení. Pokud jsou protilátky přítomné, vytvoří imunokomplex s HSV, ten vyváže komplement a vzniká sraženina. Proto nedochází k lýze ovčích erytrocytů (volný komplement není v dispozici). Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

Nepřímá hemaglutinace používá taninované erytrocyty s citlivostí vůči HSV-1 nebo HSV-2. Virus se nechá působit 15 min při 37 °C. Pak se buňky 2x promyjí fosfátovým pufrem obsahujícím 1 % králičího séra a naředí se nakonec na 1 % buněčného obsahu. Provede se postupné ředění dvojkovou řadou a hodnotí se nejvyšší titr, kdy po 90 min se ještě objeví aglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

ELISA probíhá tak, že IgM protilátky specifické proti HSV-1+2 obsažené v testovaném vzorku se vážou na inaktivovaný HSV antigen v reakčních jamkách testovací destičky (60 min, 37 °C). Po promytí (4x) se konjugát kozí (nebo myší monoklonální) protilátky vůči lidskému IgM s křenovou peroxidázou váže na tyto specifické protilátky (60 min, 37 °C). Po promytí (4x) probíhá rekce tetrametylbenzidinu s enzymovou částí konjugátu (30 min, laboratorní teplota, ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (0,8 M H₂SO₄). Oranžové zbarvení, které se hodnotí fotometricky při 450/615-690 nm do 1 h. Množství navázaného konjugátu, a tedy rovněž intenzita barvy v jamkách, jsou přímo úměrné koncentraci protilátek ve vzorku. Od každé absorbance vzorku se odečítá hodnota absorbance téhož vzorku s kontrolním antigenem. Tak se získá Δ A. Je-li Δ A < 0,1 je vzorek negativní; je-li Δ A > 0,2 je vzorek pozitivní; vzorky s hodnotou 0,1 – 0,2 jsou hraniční. Nebo se určí cutoff z pozitivní kontroly a vzorky < cutoff jsou nereaktivní, > cutoff reaktivní. Obvykle se používá uvedené kvalitativní hodnocení, i když je možné v určitém intervalu i kvantitativní hodnocení α-metodou. Lipemické, hemolytické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu. Preciznost v sérii je 3,8 – 6,4 %, mezi sériemi 8,7 – 13,7 %. Relativní senzitivita je 92 %, relativní specificita je 95,8 %. Aby se předešlo falešně pozitivním výsledkům z důvodu případného vlivu revmatoidních faktorů, provádí se ošetření vzorku pomocí RF absorbentu. Ten na sebe váže IgG protilátky obsažené v testovaném vzorku. Veškeré revmatoidní faktory obsažené ve vzorku se navážou na výsledné imunokomplexy a jsou tak eliminovány. RF absorbent na sebe naváže až 15 mg IgG/ml (vztaženo na neředěný vzorek) a odstraňuje také veškeré IgG specifické pro daný virus. Tento vedlejší efekt zvyšuje senzitivitu pro stanovení IgM.

Souprava může být zaměřena pouze na anti-HSV-1 IgM. Antigen HSV v tomto případě obsahuje glykoprotein C1 (gG1). Tyto protilátky se objevují 2 – 3 měsíce po infekci. Kvantitativní stanovení je v rozsahu 0 – 200 kU/l, mez detekce 6,8 kU/l (pozitivita > 25 kU/l). Preciznost v sérii je 4,7 – 9,7 %, mezi sériemi 6,5 – 9,8 %; linearita ředění 88 – 110 %. Relativní senzitivita je 88,3 %, relativní specificita je 100 %. K dispozici je i souprava pro kvalitativní stanovení. Některé soupravy mají poloviční inkubační časy.

Souprava může také být zaměřena pouze na anti-HSV-2 IgM. Antigen HSV v tomto případě obsahuje glykoprotein G2 (gG2). Tyto protilátky se objevují několik týdnů po infekci. Obvykle se používá kvalitativní test.Cutoff se určí z pozitivní kontroly a vzorky < cutoff jsou nereaktivní, > cutoff reaktivní. Jiná souprava umožňuje kvantitativní stanovení na základě tří kalibrátorů.

Nepřímá fluorescence je mikroskopická metoda. Vzorky obsahující anti-HSV se vážou na antigeny připojené na pevnou fázi. V dalším kroku se protilátky vybarví fluoreskující značkou (fluorescein izotiokyanát FITC). Vzorky pro IgM protilátky jsou naředěny 10x a více. HSV-1 a HSV-2 jsou morfologicky a imunologicky velmi podobné a vzájemně způsobují křížovou reakci.

CLIA je kvalitativní sendvičový zábleskový postup, kdy anti-HSV ze vzorku se naváže během inkubace na magnetické částice potažené rekombinantním HSV. Po inkubaci a promytí se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgM, která je značená izoluminolem. Po inkubaci a promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HSV IgM, celá analýza trvá 20 min; dva kalibrátory adjustují vzorovou kalibrační křivku a určí se cutoff. Vzorky s koncentrací anti-HSV IgM < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,1 cutoff jsou neurčité a > 1,1 cutoff jsou reaktivní na anti-HSV IgM. Preciznost v sérii 3,5 – 14,5 %, mezi sériemi 3,5 – 19,3 %. Relativní senzitivita je 100 %, relativní specificita 92,8 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

Western blot technika se používá jako konfirmační test rozlišení mezi anti-HSV-1 a anti-HSV-2. Konjugát obsahující IgG nebo IgM protilátky je označen ALP. Postup je kombinace western blot a line-blot technik. Bílkoviny z laurylsíranového (SDS) extraktu HSV-1 jsou elektroforeticky rozděleny podle molekulové hmotnosti a přemístěny na nitrocelulózovou membránu. Membránový čip potažený HSV-2 glykoproteinem (gG2), vyčištěným afinitní chromatografií, je pak přidán k proužkům na western blot. Pásy všech specifických antigenů jsou jasně rozlišitelné. Pás gG2 umožňuje snadno rozlišit mezi infekcí HSV-1 a HSV-2. Proužky mohou být automaticky inkubovány a vyhodnocovány.

Western blot anti-HSV-1 IgM nebo anti-HSV-2 IgM může být proveden také po odstranění IgG protilátek HSV-1+2 vysrážením s lidským IgG.

Interference testu se může objevit kvůli přítomnosti protilátek IgM pacienta během časné fáze akutní infekce.