HSV Antibodies IgG, Herpes Simplex Virus (HSV) Type 1 and Type 2 Specific Antibodies IgG, HSV Ab IgG

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: EDTA, heparin nebo citrát). Stabilita v séru za laboratorní teploty 8 h, při 4 – 8 °C 2 – 5 d, při -20 °C 3 – 6 měsíců.

Fixace komplementu je semikvantitativní test, při kterém řada malých bílkovin reaguje s komplexem antigenu HSV a jeho protilátek. Napřed se tepelně denaturuje komplement séra a přidá se standardní množství morčecího komplementu. Dále se přidá HSV. Pokud nejsou přítomné protilátky vůči tomuto viru, dochází k lýze přidaných ovčích erytrocytů komplementem a vzniká růžové zbarvení. Pokud jsou protilátky přítomné, vytvoří imunokomplex s HSV, ten vyváže komplement a vzniká sraženina. Proto nedochází k lýze ovčích erytrocytů (volný komplement není v dispozici). Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

Nepřímá hemaglutinace používá taninované erytrocyty s citlivostí vůči HSV-1 nebo HSV-2. Virus se nechá působit 15 min při 37 °C. Pak se buňky 2x promyjí fosfátovým pufrem obsahujícím 1 % králičího séra a naředí se nakonec na 1 % buněčného obsahu. Provede se postupné ředění dvojkovou řadou a hodnotí se nejvyšší titr, kdy po 90 min se ještě objeví aglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

ELISA probíhá tak, že IgG protilátky specifické proti HSV-1+2 obsažené v testovaném vzorku se vážou na inaktivovaný HSV antigen v reakčních jamkách testovací destičky (60 min, 37 °C). Po promytí (4x) se konjugát králičího fragmentu F(ab)´(nebo myší monoklonální protilátky) proti lidskému IgG s POD váže na tyto specifické protilátky (60 min, 37 °C). Po promytí (4x) probíhá rekce tetrametylbenzidinu s enzymovou částí konjugátu (30 min, laboratorní teplota, ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (0,8 M H₂SO₄). Oranžové zbarvení, které se hodnotí fotometricky při 450/615-690 nm do 1 h. Množství navázaného konjugátu, a tedy rovněž intenzita barvy v jamkách, jsou přímo úměrné koncentraci protilátek ve vzorku. Od každé absorbance vzorku se odečítá hodnota absorbance téhož vzorku s kontrolním antigenem. Tak se získá Δ A. Je-li Δ A < 0,1 je vzorek negativní; je-li Δ A > 0,2 je vzorek pozitivní; vzorky s hodnotou 0,1 – 0,2 jsou hraniční. Nebo se určí cutoff z pozitivní kontroly a vzorky < cutoff jsou nereaktivní, > cutoff reaktivní. Obvykle se používá uvedené kvalitativní hodnocení, i když je možné v určitém intervalu i kvantitativní hodnocení α-metodou. Lipemické, hemolytické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu. Preciznost v sérii je 5,3 – 11,5 %, mezi sériemi 3,5 – 17,7 %. Relativní senzitivita je 93,3 %, relativní specificita je 98,3 %.

Souprava může být zaměřena pouze na anti-HSV-1 IgG. Antigen HSV v tomto případě obsahuje glykoprotein C1 (gG1). Tyto protilátky se objevují 2 – 3 měsíce po infekci. Kvantitativní stanovení je v rozsahu 0 – 200 kU/l, mez detekce 5,9 kU/l (pozitivita > 25 kU/l). Preciznost v sérii je 5,2 – 9,8 %, mezi sériemi 4,2 – 9,4 %; linearita ředění 93 – 119 %. Relativní senzitivita je 99,1 %, relativní specificita je 98,5 %. K dispozici je i souprava pro kvalitativní stanovení. Některé soupravy mají poloviční inkubační časy.

Souprava může také být zaměřena pouze na anti-HSV-2 IgG. Antigen HSV v tomto případě obsahuje glykoprotein G2 (gG2). Tyto protilátky se objevují několik týdnů po infekci. Obvykle se používá kvalitativní test.Cutoff se určí z pozitivní kontroly a vzorky < cutoff jsou nereaktivní, > cutoff reaktivní. Jiná souprava umožňuje kvantitativní stanovení na základě tří kalibrátorů.

Nepřímá fluorescence je mikroskopická metoda. Vzorky obsahující anti-HSV se vážou na antigeny připojené na pevnou fázi. V dalším kroku se protilátky vybarví fluoreskující značkou (fluorescein izotiokyanát FITC). Vzorky pro IgG protilátky jsou naředěny 100x a více. HSV-1 a HSV-2 jsou morfologicky a imunologicky velmi podobné a vzájemně způsobují křížovou reakci.

CLIA je kvalitativní sendvičový zábleskový postup, kdy anti-HSV IgG ze vzorku se naváže během inkubace na magnetické částice potažené rekombinantním HSV. Po inkubaci a promytí se přidá myší monoklonální protilátka vůči lidskému IgG, která je značená izoluminolem. Po inkubaci a promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině anti-HSV, celá analýza trvá 20 min; dva kalibrátory adjustují vzorovou kalibrační křivku a určí se cutoff. Vzorky s koncentrací anti-HSV IgG < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,1 cutoff jsou neurčité a > 1,1 cutoff jsou reaktivní na anti-HSV IgG. Preciznost v sérii 2,3 – 14,6 %, mezi sériemi 4,6 – 16,4 %. Relativní senzitivita je 96,8 %, relativní specificita 91 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

K dispozici je také podobná souprava pro průkaz anti-HSV-1 IgG, kdy jsou magnetické částice potaženy antigenem HSV-1 (glykoprotein gG1), nebo souprava pro průkaz anti-HSV-2 IgG, kdy jsou magnetické částice potaženy antigenem HSV-2 (glykoprotein gG2).

Jiné stanovení je založeno na dvoukrokové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Protilátky vůči HSV ze vzorku v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin reagují s HSV-1 a HSV-2 imobilizovaným na polystyrénové kuličce; reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytím se na jiný paratop anti-HSV naváže monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci anti-HSV IgG ve vyšetřovaném vzorku. Používají se jeden kalibrátor a pro výpočet cutoff se ještě jeho luminiscence násobí korekčním faktorem. Vzorky s koncentrací anti-HSV IgG < 0,9 cutoff se považují za nereaktivní, 0,9 – 1,1 cutoff jsou neurčité a > 1,1 cutoff jsou reaktivní na anti-HSV IgG. Preciznost v sérii je 6,2 – 13,2 %, mezi sériemi 7,6 – 25 %. Relativní senzitivita je 92 %, relativní specificita 82,7 %. Ani vysoké koncentrace triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Avšak hemolýza (zejména > 5,4 g/l) při stanovení ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sekvenčním uspořádání trvá 18 min. Vzorek (20 µl) je inkubován s biotinylovaným rekombinantním HSV-1 a rekombinantním HSV-1 značeným ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Luminiscence je přímo úměrná hladině anti-HSV-1IgG ve vzorku. Provádí se dvoubodová kalibrace, na základě které se vypočte cutoff. Vzorky < 0,6 cutoff jsou nereaktivní na anti-HSV-1 IgG, 0,6 až < 1,0 jsou neurčité a ≥ 1,0 cutoff jsou reaktivní na anti-HSV-1 IgG. Preciznost v sérii 1,0 – 1,9 %, mezi sériemi 1,6 – 2,9 %. Relativní senzitivita 99,4 %, relativní specificita je 97,6 %. Hemolýza (hemoglobin 10 g/l), chylozita (triacylglyceroly 22,6 mmol/l), ikterus (bilirubin 1130 µmol/l) a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

K dispozici je také podobná souprava pro průkaz anti-HSV-2 IgG, kdy jsou v první inkubaci použity biotinylovaný rekombinantní HSV-2 a rekombinantní HSV-2 značený ruthéniovým komplexem.

Western blot technika se používá jako konfirmační test rozlišení mezi anti-HSV-1 a anti-HSV-2. Konjugát obsahující IgG nebo IgM protilátky je označen ALP. Postup je kombinace western blot a line-blot technik. Bílkoviny z laurylsíranového (SDS) extraktu HSV-1 jsou elektroforeticky rozděleny podle molekulové hmotnosti a přemístěny na nitrocelulózovou membránu. Membránový čip potažený HSV-2 glykoproteinem (gG2), vyčištěným afinitní chromatografií, je pak přidán k proužkům na western blot. Pásy všech specifických antigenů jsou jasně rozlišitelné. Pás gG2 umožňuje snadno rozlišit mezi infekcí HSV-1 a HSV-2. Proužky mohou být automaticky inkubovány a vyhodnocovány.

Jedinci s akutní infekcí HSV nemusí v počátečních fázích infekce vykázat žádné zjistitelné množství protilátek. Nárůst množství IgG protilátek vůči HSV-1+2 se může vyskytnout u pacientů s planými neštovicemi, virem Epstein-Barrové nebo cytomegalovirem z důvodu zkřížené reaktivity v rámci skupiny herpetických virů. Výsledky od pacientů s HIV, pacientů podstupujících imunosupresivní léčbu nebo pacientů s jinými poruchami vedoucími k imunosupresi, je nutné interpretovat s obezřetností.