enzymatic test

dle typu použitého testu je možné použít název bromelinový, papainový, ficinový test, atd.

K vyšetření se používá jak sérum, tak plazma. Jako antikoagulační činidlo jsou nejvhodnější draselné soli kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA). U nesrážlivé krve je nutné vyvarovat se odběrovým zkumavkám se separačním gelem. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

Materiál je stabilní 12 h při 18 – 25 °C, 7 d při 2 – 8°C. Oddělenou plazmu nebo sérum je možné skladovat 6 měsíců při teplotě ≤ -20°C

Jedná se o doplňkový test k nepřímému antiglobulinovému testu, který slouží k odhalení přítomnosti alloprotilátek vůči erytrocytárním antigenům. V praxi se požívá komerčně dodávaný panel s 3 vyšetřovacími erytrocyty, které musí být krevní skupiny 0 (aby se vyloučila pozitivní reakce v AB0 systému). Minimální zastoupení antigenu je: C, C^W, c, D, E, e, K, k, Fy^a, Fy^b, Jk^a, Jk^b, S, s, M, n, Le^a, přičemž jedny screeningové krvinky by mněly mít fenotyp DCe/DCe (R₁R₁) a jedny DcE/DcE (R₂R₂). Antigeny Fy^a, Fy^b, Jk^a, Jk^b, S, s, by mněly být v homozygotním zastoupení. Test je možné provést jednofázově, nebo dvoufázově. U jednofázového testu se do reakční zkumavky pipetují najednou suspenze erytrocytů, vyšetřované sérum, resp. plazma a enzym. U dvoufázového provedení se nejdříve erytrocyty inkubují (5 – 15 min) s enzymem a po jejich promytí se inkubuje suspenze takto natrávených erytrocytů s vyšetřovaným sérem, resp. plazmou. Dvoufázový test je citlivější a vykazuje méně nespecifických reakcí, proto je v současnosti preferovaný. Na trhu jsou k dispozici komerčně dodávané panely už enzymaticky (papainem) natrávených erytrocytů. Nejčastěji používanými enzymy jsou bromelin, papain; méně časté jsou ficin nebo trypsin. V nízké koncentraci (0,5 – 1 %) jsou schopné natrávením membrány erytrocytů snížit záporný povrchový náboj. Erytrocyty se tak mohou více přiblížit a aglutinaci je schopné vyvolat i menší množství protilátky (zvýšení citlivosti).

 U zkumavkového testu se vyšetřované sérum resp. plazma inkubuje s panelem natrávených erytrocytů 1 h při 37°C. Po inkubaci se zkumavky centrifugují (zesílení aglutinace) a pozoruje se případná aglutinace (jak volným okem, tak pod mikroskopem). Pozitivní reakce se může projevit i hemolýzou erytrocytů. Při použití erytrocytů resuspendovaných v LISS (roztok o nízké iontové síle), lze zkrátit inkubaci z 1 h na 15 min. Za standard je považována v dnešní době technika sloupcové aglutinace.

U vyšetření sloupcovou aglutinací se využívá speciální mikrozkumavka s vrstvou dextran-akrylamidového gelu nebo skleněných mikročástic, kterou musí erytrocyty překonat při centrifugaci. Vrstvou projdou jenom neaglutinované erytrocyty.

Při hodnocení se semikvantitativně posuzuje síla reakce: 0 resp. negativní a pozitivní 1+ až 4+.

přítomnost chladových protilátek, přítomnost nespecifických protilátek na kteroukoli složku diagnostických roztoků, hemolýza, přítomnost patologických (monoklonálních) imunoglobulinů.