PAT, Direct antiglobuline test, DAT, AGH test, Coombs, Coombsův test

K vyšetření se používá jak srážlivá, tak nesrážlivá krev. Jako antikoagulační činidlo jsou nejvhodnější draselné soli kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA). U nesrážlivé krve je nutné vyvarovat se odběrovým zkumavkám se separačním gelem. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 až 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

Materiál je stabilní 12 h při 18 – 25 °C, 7 d při 2 – 8°C. 

Jedná se o imunoaglutinační metodu založenou na reakci antigen-protilátka k odhalení senzibilizace vyšetřovaných erytrocytů. K vyšetření se v současnosti používají komerčně vyráběné AGH (anti human globulin – vyráběno imunizací zvířat, nejčastěji králíků, lidským sérem) sérum, které může být jak polyspecifické, tak monoklonální. Převážně se v prvním kroku volí polyspecifické sérum (směs anti-IgG a anti-C3d) a následně při pozitivitě se provádí kvalitativní určení senzibilizace erytrocytů pomocí monoklonálních sér. Vyšetření se nejčastěji provádí v zkumavkách nebo metodou sloupcové aglutinace.  Při zkumavkovém testu se kapka vyšetřovaných erytrocytů nejprve minimálně 3x propere v nadbytku fyziologického roztoku a po poslední dekantaci se k sedimentu erytrocytů přidá AGH sérum. Sleduje se aglutinace, která se může zesílit pětiminutovou inkubací při 37°C. Aglutinace se pozoruje jak volným okem, tak pod mikroskopem. AGH je citlivá na přítomnost jakýchkoli lidských globulinů. Promytí erytrocytů je nutné, aby se odstranilo i stopové množství séra, resp. plazmy. V případě negativní reakce je nutné provést kontrolu promytí kontrolními senzibilizovanými krvinkami. Jsou to komerční krvinky, které mají na svém povrchu navázané protilátky třídy IgG. V případě správného postupu senzibilizované krvinky reagují s AGH a objeví se aglutinace. (V případě negativní reakce je nutné celý postup opakovat s důrazem na odstranění stop lidských globulinů.) Při pozitivitě je možné provést kvalitativní určení typu senzibilizace erytrocytů, a to monoklonálními diagnostickými séry obsahující anti-IgG, -IgA, -IgM, -C3d, -C3c, apod. V dalším kroku je možné provést kvantitativní hodnocení určením titru AGH séra, s kterým dávají krvinky ještě pozitivní reakci.

U vyšetření sloupcovou aglutinací se využívá speciální mikrozkumavka s vrstvou dextran-akrylamidového gelu nebo skleněných mikročástic, kterou musí erytrocyty překonat při centrifugaci. Vrstvou projdou jenom neaglutinované erytrocyty. Výhodou je, že AGH sérum je obsaženo přímo v reakčních mikrozkumavkách. Metoda sloupcové aglutinace může být také plně automatizovaná; odečet reakce je na základě analýzy obrazu. Při vyšetření používáme 0,8 – 1 % (dle způsobu provedení) suspenzi erytrocytů v LISS (roztok o nízké iontové síle).  Při provádění vyšetření metodou sloupcové aglutinace se erytrocyty nemusí promývat, jelikož nedochází ke kontaktu vyšetřovaného séra s AGH sérem. Při hodnocení se semikvantitativně posuzuje síla reakce: 0 resp. negativní a pozitivní 1+ až 4+.

přítomnost chladových protilátek, přítomnost nespecifických protilátek na kteroukoli složku diagnostických roztoků, hemolýza.