Cirkulující antikoagulans, cirkulující inhibitory, protilátky vůči koagulačním faktorům, Bethesda test, korekční test.

Vyšetření se provádí z citrátové plazmy chudé na destičky, která se získá odběrem žilní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1 díl citrátu + 9 dílů krve. Koncentrace citrátu se doporučuje v rozmezí 0,105 až 0,109 mol/l. Při venepunkci je doporučeno používat jehlu o průměru 0,7 až 1,0 mm (tenčí jehly mohou způsobit hemolýzu a předčasnou aktivaci destiček a koagulačních faktorů) a je nutné vyvarovat se použití škrtidla > 1 min. Transport materiálu do laboratoře do 30 min. Stabilita plazmy je 4 h při 15 – 25 °C. Vzorek se centrifuguje 10 min při 1800 – 2500 g, nejlépe dle doporučení výrobce odběrového systému.

V případě zmrazení plazmy lze skladovat 4 týdny při -20 °C nebo 6 měsíců při -70°C . Pro následné zpracování zmrazené plazmy je nutno plazmu rozmrazovat po dobu cca 5 min ve vodní lázni 37 °C, šetrně promíchat a ihned provést měření. Rozmražené vzorky plazmy nelze opakovaně zamrazovat.

Vyšetření se provádí na specializovaných pracovištích, nejvhodnější je odběr v místě vyšetření, v krajním případě lze transportovat plazmu na suchém ledu.

Koagulační inhibitory jsou protilátky, které jsou obvykle zaměřeny proti koagulačním faktorům (nejčastěji faktor VIII) nebo fosfolipidům (spíše fosfolipidproteinovému komplexu – lupus antikoagulans).

Přítomnost inhibitorů proti koagulačním faktorům ve vyšetřovaném vzorku se projeví prodloužením screeningových testů, hlavně protrombínového a aPTT testu, dle specificity inhibitoru. V prvním kroku se používají screeningové směsné testy s normální plazmou (nejlépe komerční plazma inhibitorů prostá). Vyšetření se provádí ve čtyřech zkumavkách: 1. normální plazma, 2. vyšetřovaná plazma, 3. směs normální plazmy a vyšetřovaného vzorku 1:1. Zkumavky inkubujeme 120 min při 37°C a poté zchladíme na ledu (zastavení reakce). Zkumavka č. 4 se obsahuje stejné objemové díly plazmy ze zkumavek č. 1 a č. 2. Poté se provede vyšetřovaný test ve všech čtyřech zkumavkách. Zkumavka č. 1 by měla vykazovat normální hodnoty, v opačném případě je test neplatný a musíme použit jinou normální plazmu. Pozitivitu ve zkumavce č. 3 hodnotíme jako přítomnost inhibitorů. V případě normalizace testu se jedná o deficit koagulačních faktorů. Zkumavka č. 4 slouží pro odlišení časově závislých a okamžitě působících inhibitorů. Lupus antikoagulans je silný inhibitor a jeho přítomnost prodlouží čas směsi již po smíchání nebo krátké inkubaci. Specifické inhibitory jednotlivých faktorů se projeví výrazněji až po 2 h inkubaci. Zjednodušená verze testů: smíchání vyšetřované plazmy s jinou vyšetřovanou negativní plazmou – je hrubě orientační test. Při pozitivitě screeningového testu a současném prokázání deficitu některého z koagulačních faktorů se provádí kvantitativní stanovení tzv. Bethesda testem. Nejčastěji se používá pro stanovení koncentrace inhibitorů faktoru VIII. Výsledek se udává v Bethesda jednotkách: 1 BU/ml plazmy odpovídá 50 % zbytkové aktivity faktoru VIII nebo IX po 2 h inkubaci s normální plazmou při 37 °C. Vyšetřovaná plazma se ředí pomocí Owrenova pufru geometrickou řadou – 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 a 1/128. Souběžně s vyšetřovanou plazmou se připraví i zkumavka s normální plazmou ředěnou pufrem v poměru 1:1. Po 2 h inkubaci s normální plazmou (zdroj FVIII) při 37°C se provede měření aktivity faktoru VIII v každé zkumavce a vypočte se reziduální množství FVIII v %. Z grafu, nebo z rovnice

y = -1,45ln(x) + 6,66

zjistíme Bethesda jednotky. Jako výsledek se uvádí aritmetický průměr ze třech ředění, u kterých se zbytková koncentrace pohybuje kolem 50%.

Pro ředění vyšetřované a normální plazmy se nedá použít fyziologický roztok. Nejvhodnější, i když nejdražší, je ředění pomocí faktor VIII deficitní plazmy, jelikož faktory jsou citlivé na změnu pH a koncentraci proteinu. Tento test se používá nejčastěji u FVIII a FIX. Obdobně ho lze použít i u jiných koagulačních faktorů. Komplikované je stanovení inhibitorů von Willebrandova faktoru. Tímto testem se inhibitor často nepodaří identifikovat, užitečnější je porovnávaní poměru aktivity s antigenem.

Falešná negativita: použití koagulačních faktorů animálního původu.

Falešná pozitivita: přítomnost inhibitorů koagulace v standardní plazmě, heparin, hirudin.