VMA, α,4-dihydroxy-3-methoxybenzenoctová kyselina; vanillylmandelic acid, vanillomandelic acid, vanilmandelic acid, 3-methoxy-4-hydroxymandelic acid

IUPAC: (RS)-hydroxy(4-hydroxy-3-methoxy-fenyl)octová kyselina

Stanovení se provádí v moči (sběr za 24 h po okyselení HCl, během sběru uchovávat v chladničce). Z léků je třeba vyloučit 2 dny inhibitory monoaminooxidázy, α-metyldopa, kyselinu acetylsalicylovou. 3 dny před sběrem pacient nesmí kávu, čaj, bylinkové čaje, ořechy, kakao, vanilkový cukr, ovoce, ovocné š
eávy. Po acidifikaci na pH 3 – 5 je moč stálá 7 d při laboratorní teplotě i při 4 °C (až 14 d), analyt v moči je stálý 1 – 6 roků při -20 °C. Diurnální variace vedou k rozdílům 11 – 30 %.

Téměř všechny postupy vyžadují extrakci nebo dělení na anexu, aby se odstranily potenciální interferenty. Dietní omezení nejsou nutné při použití chromatografických a elektroforetických metod.

Fotometrická metoda začíná extrakcí VMA z okyselené moče do etylacetátu a pak další extrakcí do roztoku uhličitanu draselného. Po přidání jodistanu sodného se VMA v extraktu oxiduje na vanilin. Vanilin se pak izoluje od kontaminujících fenolických kyselin extrakcí do toluenu a zpětnou extrakcí do K₂CO₃. Koncentrace vanilinu se stanovuje při 360 nm (i když je maximum vanilinu 348 nm, vyhýbáme se tak možným interferencím).

Jiný postup používající reakce fenolických kyselin s diazotovaným p-nitroanilinem je na interference ještě citlivější, protože vznikající příbuzné fenolické kyseliny se mohou oxidovat na vanilin.

ELISA je založena na kompetitivní reakci mezi VMA zakotvenou v jamkách mikrotitrační destičky a VMA ze vzorku o vazebná místa monoklonální myší protilátky vůči VMA s navázanou křenovou peroxidázou (inkubace 60 min. Po promytí (pouze 1x fyziologickým roztokem) se přidá tetrametylbenzidin a reakce se po 25 min zastaví stop činidlem (1 M H₂SO₄) a měří při 450 nm (absorbance je nepřímo úměrná koncentraci VMA). Všechny analytické kroky probíhají za laboratorní teploty. Rozsah měření osmi kalibrátory byl 0,32 – 40,4 µmol/l (vyšší koncentrace se ředí 20x a tím se interval rozšíří do 808 µmol/l). Analytická citlivost je 0,18 µmol/l, funkční citlivost 0,32 µmol/l. Přesnost v sérii 6,0 – 6,3 %, mezi sériemi 5,7 – 8,2 %; zpětný výtěžek je 96 – 109 %. Křížová reakce: DL-3,4-dihydroxymandlová kyselina 4 %,  vanilpyrohroznová 4 %, ostatní < 0,1 %.

FPIA sleduje výsledek kompetitivní reakce mezi VMA ze vzorku a VMA značené fluoresceinem o vazebná místa na ovčí protilátce vůči VMA. Fluorescence se detekuje při 492 nm a nepřímo úměrná koncentraci VMA. Rozsah měření je 1,5 – 1010 µmol/l. Mez detekce je 1,5 µmol/l. Preciznost v sérii je 2,5 – 7,5 %, mezi sériemi 3,8 – 7,8 %; zpětný výtěžek 92 – 108 %.  

Elektroforéza etylacetátového extraktu na acetátu celulózy při 200 – 250 V, Reakcí s diazotovaným p-nitroanilinem se vybarvují purpurové skvrny VMA, které jsou eluovány alkalickým metanolem a detekovány fotometricky při 520 nm.

Plynová chromatografie s plameno-ionizační nebo hmotnostní detekcí umožňuje současně stanovit VMA i kyselinu homovanilovou. Při detekci hmotnostní spektrometrií se používá jako vnitřní standard [¹³C₆] vanilin. Pro chromatografii se používá tri(trimetylsilyl) derivát. Detekční limit pro VNA je 0,8 pg a rozsah měření je 5 – 100 ng VMA na µg kreatininu.

Další GC postup je v kapiláře se stacionární fází 5 % fenylmetylsilikonem a používá plameno-ionizační detektor. Jako vnitřní standard slouží 3,4-dihydroxybenzoová kyselina.

HPLC je nejvíce používanou chromatografickou metodou. K detekci se používá UV, fluorimetrický nebo nejčastěji elektrochemický detektor, případně reakce po průchodu kolonou. Před HPLC analýzou se provádí částečná purifikace extrakcí nebo na ionexu. HPLC technikou lze současně s VMA identifikovat kyselinu homovanilovou, metanefriny nebo 3-metoxy-4-hydroxyfenylglykol. Jako vnitřní standard se používá izovanilmandlová kyselina. Předběžná separace se provádí na silně bazické anexové pryskyřice v acetátovém pufru. Homovanilová kyselina se odstraní promytím směsi 2 M kyseliny octové a etanolu. VMA a izo-VMA jsou pak eluovány mobilní fází (2 M H₃PO₄ + 1 M KH₂PO₄). VMA je detekována po HPLC na reverzní fázi (250x4,6 mm C₁₈, průtok 2 ml/min) elektrochemicky ampérometrickým detektorem (180 mV / 410 mV). Rozsah kalibrace 0 – 101 µmol/l.

LC-MS/MS používá jako vnitřní standard ²H₃-VMA. Osmibodová kalibrace byla v rozsahu 0 – 101 µmol/l. Před analýzou byla provedena extrakce vodným metanolem na pevné fázi (hydrofilně modifikovaný styrén). Eluát byl odpařen na vodní lázni 30 °C pod dusíkem. Odparek byl rozpuštěn v metanolu s příměsí kyseliny mravenčí a chromatografie byla prováděna s rychlost 3 min/vzorek. Hmotnostní spektrometr s pneumaticky řízenou elektrosprejí měl negativní ionizační zdroj 5000 V; monitoroval se přechod m/z 197 → 137 pro VMA a 200 → 140 pro ²H₃-VMA. Preciznost v sérii je 1,0 -6,1 %, mezi sériemi 2,5 %; zpětný výtěžek 80 – 144 %. 

Hodnoty snižuje: pH moče < 3, urémie, kyselina gentisová a homogentisová; léky: inhibitory MAO, deriváty hydrazinu, dipidolor, disulfiram, fentanyl, haemiton, chlorpromazin, imipramin, klofibrát, klonidin, morfin, nialamid, reserpin.

Hodnoty zvyšuje: chronický stres, feochromocytom, hypertyreóza, nádory, sepse, kofein, čaj, vanilka, banány, kakao, citrusové plody, kyselina 5-hydroxyindoloctová, kyselina hydroxymandlová, cvičení, histamin, migréna, hladovění, želatina, žvýkačka; léky: ajmalin, desurol, dopamin, euspiran, adrenalin, celaskon, glukagon, inzulin, isoprenalin, kyselina nalidixová, labetalol, lithium, metenamin, nitroglycerin, noradrenalin, oxytetracyklin, propranolol, spasmoveralgin, vitaminy skupiny B.