carcinoembryonic antigen, CEACAM5

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans EDTA nebo heparin) - některé prameny stanovení v plazmě nedoporučují - případně v likvoru. Stabilita CEA v séru: 1 – 7 d při 4 – 8 °C, 6 měsíců při -20 °C. Hemolýza neinterferuje se stanovením, ale svědčí o nevhodném zacházení se vzorkem. Důležitý je odběr vždy ve stejnou dobu. Transport mezi laboratořemi na suchém ledu.

IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči CEA a přidáním druhé protilátky (polyklonální kozí) vůči CEA značené ¹²⁵I. Po inkubaci (2 h, laboratorní teplota, třepání – je možný také sekvenční postup dvou inkubací jednotlivých protilátek 2x1 h s dekantací mezi inkubacemi) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Rozsah metody je 0,19 – 325 µg/l (některé soupravy do 600 µg/l), analytická citlivost 0,19 µg /l, funkční citlivost 0,38 µg/l. Preciznost v sérii je ≤ 4,3 %, mezi sériemi ≤ 6,2 %; zpětný výtěžek 91,5 – 102 %, linearita ředění 95,4 – 116 %. Vysoké koncentrace bilirubinu, hemoglobinu a lipémie mohou stanovení ovlivnit. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 20000 µg /l (některé soupravy do 125000 µg/l). Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

ELISA v sendvičovém uspořádání probíhá v mikrotitrační destičce se zakotvenou protilátkou vůči CEA. Do jamky se přidá standard nebo vzorek a inkubuje se 2,5 h (třepání). Po inkubaci a promytí 4x se přidá biotinylovaná protilátka vůči CEA a inkubuje se 1 h (třepání). Po inkubaci a promytí 4x se přidá streptavidin s navázanou křenovou peroxidázou a inkubuje se 45 min (třepání). Celý postup lze také provést jako jednostupňovou sendvičovou metodu během 1 h inkubace, kdy druhá protilátka má už konjugovanou POD. Po inkubaci a promytí 4x se přidá chromogen tetrametylbenzidin a reakce probíhající 30 min (v některých soupravách jen 10 min) ve tmě (třepání) je zastavena stop činidlem. Měření se provádí ihned (nebo do 15 min) při 450 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Ruší silná hemolýza a projevuje se efekt nadbytku antigenu. Rozsah měření na základě osmibodové (šestibodové) kalibrace je 0,2 – 250 µg/l (po ředění do 500 µg/l). Detekční limit je 0,2 µg/l. Preciznost v sérii je < 10 %, mezi sériemi < 12 %. Linearita ředění 81 – 106 %, zpětný výtěžek 82 – 124 %.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči CEA a pufr. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se druhá myší monoklonální protilátka vůči CEA značená ALP. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,5 – 500 µg/l. Vzorky s koncentrací CEA > 500 µg/l se ředí manuálně dle potřeby. Preciznost v sérii je 3,2 – 7,0 %, celková preciznost metody je 4,0 – 9,7 %; zpětný výtěžek 94,7 – 104,0 %. Analytická citlivost je 0,5 µg/l (2 SD nulového blanku). Při koncentraci 64000 µg/l nebyl zaznamenán detekovatelný přenos. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Při testování zavlečené chyby 70000 µg/l byl zjištěný přenos 10 ppm.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena protilátka vůči CEA. V sekvenčním uspořádání se pipetuje CEA ze vzorku a po inkubaci a promytí se přidá specifická protilátka značená Eu³⁺. Po inkubaci a promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci CEA ve vzorku a měří se do 1 h. Mez detekce metody je 0,05 µg/l. Rozsah metody do 500 µg/l. Preciznost mezi sériemi 7,0 – 8,6 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺ v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Sendvičová reakce probíhá 39 min mezi CEA ze vzorku, monoklonální protilátkou vůči CEA značenou Eu³⁺ a monoklonální protilátkou vůči CEA, která je připojena na sběrný protein. Měřený signál je po sendvičové imunoreakci (připojení obou značených monoklonálních protilátek k CEA) přímo úměrný hladině CEA. Na základě jednobodové kalibrace je rozsah měření 0,2 – 160 µg/l, po automatickém ředění až do 100000 µg/l. Analytická citlivost 0,2 µg/l; funkční citlivost 1,0 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 100000 µg/l. Linearita ředění 90 – 110 %. Preciznost v sérii 1,7 – 3,1 %, mezi sériemi 3,3 – 6,2 %. Hemolýza, chylozita a ikterus stanovení neruší.

Chemiluminiscenční analýza - stanovení je založeno na nekompetitivní (sendvičové) imunochemické reakci s detekcí záblesku vzniklého chemiluminiscenční reakcí. CEA se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na purifikovanou polyklonální králičí protilátku značenou esterem akridinu. Následně se přidává monoklonální myší protilátka, která je kovalentně vázaná na paramagnetické částice niklu. Reakce probíhá 7,5 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odsátím a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci CEA ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě sedmibodové základní kalibrace při použití nových šarží činidel a dvoubodové rekalibrace po dvou nejpozději však čtyřech týdnech. Linearita metody je do 100 µg/l. Vzorky s koncentrací CEA vyšší než 100 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Používané manuální nebo automatické ředění je 1:5, 1:10, 1:50 a 1:100. Naměřený výsledek obsluha nebo přístroj násobí 5x, 10x, 50x nebo 100x. Konečná koncentrace CEA ve zředěném roztoku musí být ≥ 15,1 µg/l. Detekční limit metody je 0,5 µg/l. Preciznost v sérii 2,1 – 3,6 %, mezi sériemi 2,7 – 4,1 %. Zpětný výtěžek:  80,2 – 106,4 %, linearita ředění: 108,6 – 152,2 %. Efekt nadbytku antigenu se do 100000 µg/l neprojevuje. Při metodě neruší: hemoglobin do koncentrace 5 g/l, triacylglyceroly do koncentrace 11,4 mmol/l, bilirubin do koncentrace 342µmol/l. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Jiná chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání používá myší monoklonální protilátku vůči CEA, zakotvenou na paramagnetických částicích ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči CEA značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná koncentraci CEA a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky v rozmezí koncentrací 0,5 – 1500 µg/l (vyšší koncentrace se ředí automaticky 10x nebo manuálně 100x, resp. 1000x). Preciznost v sérii 2,1 – 3,6 %, celkově 2,5 – 4,0 %. Zpětný výtěžek je 95,1 – 105,6 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového blanku) je 0,5 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 60000 µg/l. Při testování zavlečené chyby 43630 µg/l byl zjištěný přenos < 12 ppm. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou se naváže během první inkubace (10 min) CEA a po promytí se na jeho další epitop připojí během další inkubace (10 min) druhá monoklonální myší protilátka značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině CEA. Rozsah měření je na základě dvoubodové kalibrace 0,2 – 1000 µg/l (při vyšších hodnotách lze sérum ředit diluentem dle potřeby). Analytická citlivost je 0,2 µg/l. Preciznost v sérii 2,1 – 4,8 %, mezi sériemi 2,8 – 6,6 %. Linearita ředění je 99 – 110 %, zpětný výtěžek 92 – 100 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Jiné stanovení je založeno na sekvenční imunochemické reakci, kde je ALP jako marker. CEA se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže jedním epitopem na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí reaguje druhý epitop CEA s polyklonální králičí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci CEA ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Linearita metody je do 550 µg/l. Vzorky s koncentrací CEA vyšší než 550 µg/l se ředí univerzálním diluentem. Doporučené ředění je 1 díl vzorku + 9 dílů ředícího roztoku (lze provádět automaticky na analyzátoru nebo manuálně) a naměřený výsledek přístroj nebo obsluha (v manuálním postupu) násobí 10x. Vzorky s extrémně vysokými koncentracemi CEA lze ředit manuálně podle potřeby. Detekční limit metody: 0,15 µg/l (2 SD). Preciznost v sérii 2,7 – 3,7 %, celkově 4,5 – 9,8 %; zpětný výtěžek:  91 – 103 %, linearita ředění 85 – 107 %. Efekt nadbytku antigenu se do 250000 µg/l neprojevuje. Hemoglobin do koncentrace 3,81  g/l, triacylglyceroly do koncentrace 33,9 mmol/l a bilirubin do koncentrace 342µmol/l neinterferují. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje myší monoklonální protilátka vůči CEA značená ALP a standard nebo vzorek. Pak se přidají paramagnetické částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči CEA. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,1 – 1000 µg/l (po ředění 10x až 10000 µg/l). Analytická citlivost (nulový kalibrátor) 0,1 µg/l. Linearita ředění je 94 – 107 %, zpětný výtěžek 98,5 – 109,9 %. Preciznost v sérii 3,01 – 3,97 %, celková 3,8 – 4,51 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl prokázán do 100000 µg/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu, RF (< 500 kU/l) a triacylglycerolů neruší. Heterofilní protilátky v lidském séru/plazmě mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy CEA ze vzorku se váže na biotinylovanou myší monoklonální protilátku vůči CEA a současně se na druhý epitop CEA váže myší monoklonální protilátka vůči CEA značená křenovou peroxidázou. Vzniklý imunokomplex se naváže na jamky potažené streptavidinem svou biotinovou kotvou. Po inkubaci (30 min, 37 °C) se promytím odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě dvoubodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci CEA ve vzorku. Rozsah měření 0,31 – 400 µg/l (vyšší koncentrace CEA jsou automaticky ředěné až 100x). Analytická senzitivita 0,06 µg /l, funkční senzitivita 0,31 µg /l. Preciznost v sérii 1,3 – 2,2 %, mezi sériemi je 1,5 – 3,9 %. Hladiny biotinu zůstávají v séru zvýšené 24 h po podání. Efekt nadbytku antigenu se projevuje nad 180000 µg /l. Při stanovení interferuje hemolýza (vyšší výsledky).

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči CEA. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči CEA a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-CEA-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný koncentraci CEA ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je 0,2 – 1000 µg/l (automatické ředění umožňuje zvětšit rozsah měření 20x). Detekční limit je 0,2 µg/l. Preciznost v sérii 1,3 – 2,9 %, celková 3,8 – 4,51 %.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (10 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči CEA a monoklonální myší protilátkou vůči CEA značenou ruthéniovým komplexem za vzniku sendvičové formace. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem a celý komplex je vázán na pevnou fázi pomocí biotin-streptavidinové kotvy. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná koncentraci CEA ve vzorku. Chylozita, hemolýza, ikterus a RF (< 1500 kIU/l) neruší. Od pacientů léčených vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměly odebírat vzorky dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Metoda je použitelná v rozsahu 0,2 – 1000 µg/l (ředění 50x automaticky umožňuje měření do 50000 µg/l. Detekční limit je 0,61 µg/l. Preciznost v sérii CV 1,0 – 2,5 %, mezi sériemi 4,6 – 5,1 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 200000 µg/l. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek proti streptavidinu nebo rutheniu.

Toleranční limit EHK: 16 %.

Zvýšené hodnoty: kuřáci (asi 15 % má hodnoty > cut-off), kontaminace slinami, alkoholismus, zánětlivé stavy (játra, pankreas, střeva, plíce), hemodialýza, obezita (3 %).

Nespecifická interference v přítomnosti myších protilátek (HAMA).