OxLDL, oxidized LDL

Pro analýzu lze použít plazmu s EDTA nebo heparinem. Plazma nebo sérum se musí odstředit před aplikaci precipitačního činidla.

Při oxidaci nenasycených mastných kyselin s více dvojnými vazbami vznikají reaktivní aldehydy malondialdehyd (MDA) a 4-hydroxynonenal (HNE), které se váží na lysinové zbytky ApoB-100 a vznikají adukty MDA-LDL a HNE-LDL. Také vznikají konečné produkty pokročilé glykosylace CML-LDL (N-karboxymetyllysin) a CEL-LDL (N-karboxyetyllysin), tedy celkem 4 druhy oxidovaného LDL-cholesterolu. K dispozici jsou tři specializované ELISA soupravy, ale také ELISA pro sumární oxidovaný LDL-cholesterol.

ELISA stanovení CML-LDL se provádí v dubletu za laboratorní teploty v mikrotitračních destičkách a souprava obsahuje standard LDL-cholesterolu oxidovaného měďnatými ionty. Mez detekce metody je 150 µg/l. Stanovení lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických tekutinách. V biologickém materiálu se vysráží LDL, postup se zopakuje a následuje centrifugace a dekantace. LDL se rozpustí ve fosfátovém pufru a pipetuje se do jamky potažené kotvící protilátkou vůči CML-LDL (inkubace 1 h). Po trojnásobném promytí se přidá ředěné blokační činidlo (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Přidá se ředěná kozí polyklonální protilátka vůči ApoB100 s biotinylovou koncovkou (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Následně se přidá enzym se streptavidinovým můstkem, který se na ni zachytí (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Po přidání teplého substrátu (třepání 5 – 20 min) a zastavení barevné reakce stop činidlem se ihned provádí fotometrické měření při 450 nm. Kalibrace je osmibodová. Naměřená absorbance je přímo úměrná koncentraci CML-LDL.

ELISA stanovení HNE-LDL se provádí v dubletu za laboratorní teploty v mikrotitračních destičkách a souprava obsahuje standard LDL-cholesterolu oxidovaného měďnatými ionty. Mez detekce metody je 150 µg/l. Stanovení lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických tekutinách. V biologickém materiálu se vysráží LDL, postup se zopakuje a následuje centrifugace a dekantace. LDL se rozpustí ve fosfátovém pufru a pipetuje se do jamky potažené kotvící protilátkou vůči HNE-LDL (inkubace 1 h). Po trojnásobném promytí se přidá ředěné blokační činidlo (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Přidá se ředěná kozí polyklonální protilátka vůči ApoB100 s biotinylovou koncovkou (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Následně se přidá enzym se streptavidinovým můstkem, který se na ni zachytí (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Po přidání teplého substrátu (třepání 5 – 20 min) a zastavení barevné reakce stop činidlem se ihned provádí fotometrické měření při 450 nm. Kalibrace je osmibodová. Naměřená absorbance je přímo úměrná koncentraci HNE-LDL.  

ELISA stanovení MDA-LDL se provádí v dubletu za laboratorní teploty v mikrotitračních destičkách a souprava obsahuje standard LDL-cholesterolu oxidovaného měďnatými ionty. Mez detekce metody je < 50 µg/l. Stanovení lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických tekutinách. V biologickém materiálu se vysráží LDL, postup se zopakuje a následuje centrifugace a dekantace. LDL se rozpustí ve fosfátovém pufru a pipetuje se do jamky potažené kotvící protilátkou vůči MDA-LDL (inkubace 1 h). Po trojnásobném promytí se přidá ředěné blokační činidlo (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Přidá se ředěná kozí polyklonální protilátka vůči ApoB100 s biotinylovou koncovkou (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Následně se přidá enzym se streptavidinovým můstkem, který se na ni zachytí (třepání 1 h) a jamky se 5x promyjí. Po přidání teplého substrátu (třepání 5 – 20 min) a zastavení barevné reakce stop činidlem se ihned provádí fotometrické měření při 450 nm. Kalibrace je osmibodová. Naměřená absorbance je přímo úměrná koncentraci MDA-LDL.

ELISA stanovení sumárního oxidovaného LDL-cholesterolu lze provádět v séru, plazmě i jiných biologických tekutinách. Standard nebo vzorek se pipetuje do jamky potažené kotvící protilátkou vůči oxidovanému LDL-cholesterolu (inkubace 2 h při 37 °C). Přidá se ředěná protilátka vůči oxidovanému LDL-cholesterolu s biotinylovou koncovkou (inkubace 1 h) a jamky se 3x promyjí. Následně se přidá enzym s avidinovým můstkem, který se na ni zachytí (inkubace 30 min) a jamky se 5x promyjí. Po přidání substrátu tetrametylbenzidinu (inkubace 15 – 25 min) a zastavení barevné reakce stop činidlem (ředěná H₂SO₄) se ihned provádí fotometrické měření při 450±10 nm.Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 31 – 2000 ng/l, mez detekce metody je 1,25 ng/l. Preciznost v sérii je 10 %, mezi sériemi 12 %, zpětný výtěžek v plazmě 78 – 103 %, v séru 89 – 97 %. Linearita ředění v plazmě 78 – 104 %, v séru 85 – 103 %.

Žádné interference nejsou v literatuře uvedené.