Aspergillus antibodies

Stanovení se provádí v séru (případně v likvoru). Sérum je třeba separovat do 2 h. Stabilita 20 – 25 °C 2 d, 4 – 8 °C 14 d, -20 °C 1 rok.

Imunodifuze – přítomnost protilátek (IgG, IgA, IgM) vytváří s plísní Aspergillus precipitační pásy.

Fixace komplementu je semikvantitativní test, při kterém řada malých bílkovin reaguje s komplexem antigenu Aspergillus a jeho protilátek. Napřed se tepelně denaturuje komplement séra a přidá se standardní množství morčecího komplementu. Dále se přidá Aspergillus. Pokud nejsou přítomné protilátky vůči této plísni, dochází k lýze přidaných ovčích erytrocytů komplementem a vzniká růžové zbarvení. Pokud jsou protilátky přítomné, vytvoří imunokomplex s plísní Aspergillus a ten vyváže komplement a vzniká sraženina. Proto nedochází k lýze ovčích erytrocytů (volný komplement není v dispozici).  

ELISA IgG (např. A. fumigatus) v sendvičovém uspořádání se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem Aspergillus. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky 60 min inkubují. Obsah jamek se vyprázdní a jamky se promyjí třikrát fosfátovým pufrem. Přidá se protilátka vůči lidskému IgG značená křenovou peroxidázou, roztok se inkubuje 30 min a opět se obsah jamek vyklepne a třikrát promyje fosfátovým pufrem; přidá se substrát tetrametylbenzidin a následuje další inkubace 20 min ve tmě. Další krok je přidání stop činidla (0,5 M H₂SO₄) a následuje měření při 450 nm (proti 600 – 650 nm), které nutno provést do 60 min. Signál je přímo úměrný množství stanovované protilátky. Stanovení se provádí při teplotě 18 – 25 °C. Čtyřbodová kalibrace umožňuje měřit v rozsahu 1 – 200 kU/l (vyšší hodnoty protilátky se ředí dilučním fosfátovým pufrem). Analytická citlivost 1,08 kU/l. Linearita ředění je 74 – 114 %, zpětný výtěžek 87 – 97 %. Preciznost v sérii 9,9 %, mezi sériemi 11,1 %. Stanovení neruší hemoglobin do 8 g/l, triacylglyceroly do 5,65 mmol/l ani bilirubin do 513 µmol/l.

ELISA IgM (např. A. fumigatus) v sendvičovém uspořádání se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem Aspergillus. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky 60 min inkubují. Obsah jamek se vyprázdní a jamky se promyjí třikrát fosfátovým pufrem. Přidá se protilátka vůči lidskému IgM značená křenovou peroxidázou, roztok se inkubuje 30 min a opět se obsah jamek vyklepne a třikrát promyje fosfátovým pufrem; přidá se substrát tetrametylbenzidin a následuje další inkubace 20 min ve tmě. Další krok je přidání stop činidla (0,5 M H₂SO₄) a následuje měření při 450 nm (proti 620 nm), které nutno provést do 60 min. Signál je přímo úměrný množství stanovované protilátky. Stanovení se provádí při teplotě 18 – 25 °C. Čtyřbodová kalibrace umožňuje měřit v rozsahu 1 – 60 kU/l (vyšší hodnoty protilátky se ředí 100x dilučním fosfátovým pufrem). Analytická citlivost 1,04 kU/l. Linearita ředění je 95 – 120 %, zpětný výtěžek 90 – 104 %. Preciznost v sérii 5,9 %, mezi sériemi 5,5 %. Stanovení neruší hemoglobin do 8 g/l, triacylglyceroly do 5,65 mmol/l ani bilirubin do 513 µmol/l.

ELISA IgA (např. A. fumigatus) v sendvičovém uspořádání se provádí v mikrotitračních destičkách se zakotveným antigenem Aspergillus. Kalibrátory nebo ředěné vzorky se pipetují do jamek, pak se roztoky 60 min inkubují. Obsah jamek se vyprázdní a jamky se promyjí třikrát fosfátovým pufrem. Přidá se protilátka vůči lidskému IgA značená křenovou peroxidázou, roztok se inkubuje 30 min a opět se obsah jamek vyklepne a třikrát promyje fosfátovým pufrem; přidá se substrát tetrametylbenzidin a následuje další inkubace 20 min ve tmě. Další krok je přidání stop činidla (0,5 M H₂SO₄) a následuje měření při 450 nm (proti 620 nm), které nutno provést do 60 min. Signál je přímo úměrný množství stanovované protilátky. Stanovení se provádí při teplotě 18 – 25 °C. Čtyřbodová kalibrace umožňuje měřit v rozsahu 1 – 140 kU/l (vyšší hodnoty protilátky se ředí dilučním fosfátovým pufrem). Analytická citlivost 1,14 kU/l. Linearita ředění je 72 – 118 %, zpětný výtěžek 83 – 93 %. Preciznost v sérii 7,5 %, mezi sériemi 12,3 %. Stanovení neruší hemoglobin do 8 g/l, triacylglyceroly do 5,65 mmol/l ani bilirubin do 513 µmol/l.

CAP-FEIA IgE (např. A. fumigatus) je semikvantitativní test, kdy je plíseň Aspergillus zakotvena na hydrofobním celulózovém polymeru (využívá se jeho velká vazebná kapacita). Provádí se vysoko-afinitní fluorescenční imunoanalýza, kdy lze prokázat již 0,1 kU/l protilátky.

CRP může poskytnout falešný precipitační pás při imunodifuzi.