Termíny jako citlivý, ultrasenzitivní, supersenzitivní, vysoce citlivý jsou výrobci analytických souprav používány
k propagaci jejich nových TSH testů. Tato adjektiva přitahují pozornost k novým TSH soupravám, ale také vytvářejí mnoho nedorozumění co se týká jejich přesného významu. Třídění TSH podle generací je založeno
na představě, že každá generace představuje desetinásobné zdokonalení funkční citlivosti, což by mělo jednoznačně vysvětlit dosud zmatečnou terminologii. První generace TSH souprav byly běžné RIA s funkční citlivostí 1 – 2 mU/l a byla použitelná pouze k rozlišení hypothyreoidismu a euthyreoidismu. Imunometrické testy TSH druhé generace detekovaly 0,1 – 0,2 mU/l a mohly rozlišit nejen hypothyreoidismus, ale také hyperthyreoidismus od euthyreoidismu. Třetí generace vykazuje funkční citlivost 0,01 – 0,02 mU/l a kromě diagnózy obou poruch umožňuje také zjistit závažnost hyperthyreoidismu. Čtvrtá generace má citlivost 0,001 – 0,002 mU/l.
Výrobci imunoanalytických souprav pro stanovení TSH obvykle vyjadřují detekční limit jako zdánlivou koncentraci TSH, odpovídající dvěma směrodatným odchylkám nad signálem pro nulový kalibrátor
(tj. analytická citlivost). Tento analytický limit ale nemusí odpovídat výsledkům měření vzorků, provedených jiný den a s odlišnou šarží činidel. Proto bylo navrženo používat ke třídění TSH souprav funkční citlivost (tj. nejnižší koncentraci TSH s CV mezi soupravami 20 %).
Jak analytická, tak funkční citlivost jsou založeny na statistické extrapolaci dat a nikoliv na skutečném měření nejmenšího stanovitelného množství TSH. Analytická citlivost je nejmenší signál, který lze statisticky rozlišit
od signálu matrice používané při analytické metodě; lze si představit, že tento signál může být překročen interferujícími látkami a TSH přítomným ve vzorku, ale nikoliv samotnou matricí analytické soupravy. Byla doporučena také technika opakovaného ředění vzorku a největší ředění, kdy ještě bylo dosaženo CV ±20 % představovalo nejnižší stanovitelnou koncentraci. Pro TSH druhé generace je tato koncentrace 0,10 –
0,65 mU/l.
Typické pro stanovení TSH jsou neizotopové imunoanalýzy na principu EIA, FIA a LIA. Další postupy, jako radioimunoanalýza a cytochemická analýza mají jen okrajové využití.
Radioimunoanalýza měří imunologickou aktivitu, nikoliv biologickou aktivitu cirkulujícího TSH, ačkoliv jsou výsledky tradičně vyjadřovány jako biologická aktivita v mU/l séra. Přitom je možné, že TSH molekula ztratí svou biologickou aktivitu, aniž ztratí imunologickou aktivitu. Nicméně dostupná data ukazují, že měření koncentrace TSH RIA dobře koreluje s biologickou aktivitou. Rutinní stanovení TSH se začalo provádět teprve až byl
k dispozici purifikovaný TSH z hypofýzy a bylo možné připravit protilátky. Hormon byl k dispozici také
k radioaktivnímu značení a jako standard. Detekční limit většiny RIA metod je kolem 1 mU/l, což není dostatečné pro měření TSH ve zdravé populaci. Proto byla kompetitivní RIA (TSH ze vzorku soutěžil s TSH značeným 125I
o omezený počet vazebných míst na protilátce) nahrazena citlivějšími nekompetitivními imunometrickými analýzami.
Nekompetitivní sendvičová IRMA na pevné fázi používá kotvící myší monoklonální protilátku vůči TSH a signální polyklonální kozí protilátku značenou 125I vůči odlišnému epitopu TSH. Obě protilátky jsou v přebytku
a navzájem spolu nereagují. Vzniklý imunokomplex se oddělí, promyje a měří. Radioaktivita je přímo úměrná koncentraci TSH ve vzorku. Kalibrační rozsah 0,15 – 60 mU/l, analytická citlivost 0,03 mU/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 1,9 – 5,8 %, mezi sériemi 3,4 – 9,0 %; výtěžnost 90 – 108 %. Také tento postup se používá omezeně. Podle průzkumu College of American Pathologists 99 % laboratoří už v roce 2001 používalo neizotopové postupy.
ELISA používá sendvičové uspořádání. Zkumavka je potažena streptavidinem, který váže 4 molekuly biotinu.
Na kotvící protilátku je připojen biotin. Křenová peroxidáza se používá jako značka signální protilátky. Poté co se TSH oběma vazebnými epitopy váže na protilátky se imunokomplex promyje a přidá se chromogenní substrát ke stanovení aktivity POD. Díky přebytku vazebných míst streptavidinu se zlepšuje preciznost a citlivost metody.
ELISA může použít také mikrotitrační jamky přímo potažené monoklonální protilátkou vůči TSH. Po přidání vzorku se pipetuje druhá polyklonální protilátka vůči TSH, značená křenovou peroxidázou a po inkubaci tetrametylbenzidin a peroxid vodíku jako substráty. Reakce se zastavuje ředěnou 1M kyselinou sírovou a měří se absorbance při 450 nm. Měřící rozsah 0,2 – 40 mU/l, citlivost 0,2 mU/l. Jiný výrobce 0,1 – 30 mU/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 3,9 – 6,4 %, mezi sériemi 7,0 – 8,42 %; výtěžnost 92 – 109 %, linearita 85 – 105 % . Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 2000 mU/l.
Podobný princip vazby jako streptavidin-biotin je mezi fluorescein izothiokyanátem (FITC) a vysoce imunogenní skupinou protilátky vůči FITC, která je vázána na magnetické částice. Protilátka vůči TSH s navázaným FITC
a značená ALP je inkubována se sérem. Pak se přidají magnetické částice potažené anti-FITC a tím se umožní oddělení nadbytečné protilátky vůči TSH, značené ALP, v magnetické poli, zatímco imunokomplex rychle sedimentuje. Imunoreakce u této metody probíhá v kapalné fázi, ale difúze a geometrické usměrnění se děje na pevné fázi. Imunoreakce je jednostupňová a zkracuje se reakční čas.
Reakce může proběhnout také jako klasická imunoenzymometrická analýza (IEMA) se signální protilátkou značenou ALP.
FIA používá magnetické nebo latexové mikrokuličky potažené monoklonální protilátkou vůči TSH, značkou je ALP a substrátem 4-metylumbeliferylfosfát. Fluorescence se měří při 448 nm (excitace při 365 nm).
MEIA používá dvě protilátky vůči TSH, z nichž jedna je zakotvena na latexové mikrokuličky o průměru 0,47 µm
a druhá protilátka vůči jinému epitopu TSH je značená ALP. Vzniklý imunokomplex je oddělen na skleněné fritě
a po promytí reaguje s 4 metylumbeliferylfosfátem a měří se intenzita fluorescence vznikajícího
4-metylumbeliferonu při 450 nm. Koncentrace TSH je přímo úměrná intenzitě fluorescence (tj. aktivitě ALP). Přitom nebyla prokázána žádná křížová reaktivita hCG, FSH nebo LH. Citlivost metody je 0,02 mU/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 5,1 – 8,8 %. Protilátka vůči TSH může být také zakotvena na magnetických kuličkách a imunokomplex separován magnetem. Obě metody se používají na automatických analyzátorech.
Imunofluorimetrická analýza (IFMA, DELFIA) využívá protilátku vůči TSH označenou chelátem europia
a fluorescenci rozloženou v čase jako detekční metodu. U většiny fluorescenčních imunoanalýz se setkáváme
s vysokým signálem pozadí a v důsledku toho s nízkou citlivostí. Aby se zamezilo vysokému pozadí, jsou vzorky obvykle před fluorescenční imunoanalýzou upraveny. Chelát europia má mnohem delší poločas rozpadu (10-3 až 10-6 s), než je běžně emitovaná fluorescence sloučenin způsobujících fluorescenční pozadí (10-8 až 10-9 s), takže tato specifická fluorescence se může měřit po vymizení signálu pozadí. Při této metodě se používají dvě protilátky vůči odlišným epitopům β-podjednotky TSH; jedna monoklonální protilátka je označena nefluoreskujícím chelátem europia a druhá je zakotvena na mikrotitrační destičce. Provede se inkubace séra
s oběma protilátkami při laboratorní teplotě; jamky se poté odsají a promyjí, aby se odstranila nenavázaná signální protilátka. Fluorescence europiového iontu se projeví teprve po jeho disociaci, ke které dochází prostřednictvím zesilovacího roztoku obsahujícího ligandy absorbující energii, jež jsou vyžadovány pro vznik fluoreskujícího chelátu (tri-n-oktylfosfinoxid a 2-naftoyltrifluoraceton). Emise světla europiového iontu je měřena fluorimetrem po dobu 400 ms. Touto technikou lze měřit koncentrace 10-14 M a teoreticky lze citlivost ještě zvýšit, protože na molekulu protilátky se může připojit několik iontů europia. Postup může být částečně nebo úplně automatizovaný. Rozsah měření 0,005 – 100 mU/l. Reprodukovatelnost v sérii má CV 1,9 – 6,7 %, mezi sériemi 5,0 – 5,9 %.
Luminiscenční imunoanalýza používá buď luminogen jako značku nebo jako substrát. Takovým substrátem je dioxetanfenylfosfát, který je štěpen ALP ze signální protilátky. Tato protilátka je zakotvena na paramagnetických částicích (magnetická separace) nebo polystyrénových kuličkách (separace centrifugací v podélné ose).
Imunoluminometrická analýza (ILMA) je založena na nekompetitivní vazbě TSH na přebytek protilátky označené esterem akridinu. Metoda je plně automatizovaná a může prokázat až 0,04 mU/l TSH. Extrémně vysoká citlivost metody je dosažena díky značce, která vykazuje intenzivní luminiscenci. ILMA využívá oba epitopy TSH. Kotvící monoklonální kozí protilátka proti prvnímu epitopu je v prostředí pufru HEPES (N-2-hydroxyetylpiperazin-
N´-etansulfonová kyselina), obsahujícího hovězí sérový albumin, kovalentně vázána na ester akridinu. Současně je na druhý epitop TSH připojen na kozí monoklonální protilátku proti myšímu IgG s navázaným fluoresceinizothiokyanátem (FITC). Následně se přidává kozí monoklonální protilátka proti FITC, která je kovalentně vázaná na paramagnetické částice niklu. Po odstranění nemagnetického materiálu odsátím
a promytím se přidá alkalizovaný peroxid vodíku, který vyvolá chemiluminiscenční záblesk detekovaný luminometrem. Intenzita luminiscence je přímo úměrná množství TSH ve vzorku. Linearita: do 150 mU/l, detekční limit: 0,001 mU/l (2 SD), funkční citlivost: 0,008 mU/l (CV ≤ 20 %), reprodukovatelnost v sérii CV 1,44 – 2,85 %, v čase 0,88 – 2,35 %, výtěžnost: 91 – 108,3 %. Efekt nadbytku antigenu se do 2000 mU/l neprojevuje.
LIA stanovení s využitím volného substrátu je založeno na sendvičové imunochemické reakci. TSH se
v prostředí pufrovaného roztoku jedním epitopem váže na monoklonální myší protilátku imobilizovanou na polystyrénové kuličce a druhým epitopem reaguje s polyklonální kozí protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření je přímo úměrná koncentraci TSH ve vyšetřovaném vzorku. Linearita: do 75 mU/l, detekční limit
0,01 mU/l (2 SD), funkční citlivost 0,01 mU/l (CV ≤ 20 %); reprodukovatelnost v sérii pro 0,13 mU/l CV < 7,8 %,
v čase pro 0,13 mU/l CV < 12,4 %; výtěžnost: 97 – 111 %. Efekt nadbytku antigenu se do 7200 mU/l neprojevuje. ALP může reagovat i s jiným luminiscenčním činidlem, např. Lumi-Phos 530. Zkumavky jsou potažené konjugátem kozí polyklonální TSH protilátky s ALP, do nich se pipetuje vzorek a přidají se paramagnetické částice potažené monoklonální myší protilátkou vůči TSH v pufru TRIS s hovězím albuminem. Po separaci
v magnetickém poli se promytím odstraní nenavázané složky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Rozsah měření při 470 nm je 0,01 – 100 mU/l. Analytická citlivost 0,003 mU/l (2 SD), funkční citlivost 0,01 – 0,02 mU/l (CV ≤ 20 %). Reprodukovatelnost v jednotlivých sériích měla CV 3,5 – 8,5 %.
Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza (LOCI) je založena na sendvičovém principu. Dvě činidla jsou zakotvena na kuličkách a dále je v reakci použitý biotinylovaný fragment monoklonální protilátky vůči TSH. První kulička (Sensibeads) je potažena streptavidinem a obsahuje barvivo citlivé na světlo. Druhá kulička (Chemibeads) je potažena druhou monoklonální protilátkou a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Vzorek je inkubován s biotinylovanou protilátkou a druhou kuličkou s protilátkou značenou chemiluminiscenčním barvivem. Ke vzniklému sendviči se přidá první kulička potažená streptavidinem a vznikne imunokomplex se dvěma kuličkami. Ozářením imunokomplexu světlem 680 nm vzniká na fotocitlivém barvivu singletový kyslík, který difunduje do chemiluminiscenčního barviva a spouští chemiluminiscenční reakci. Generované světlo se měří při 612 nm a je přímo úměrné koncentraci TSH ve vzorku. Analytická i funkční senzitivita byly 0,005 mU/l. Reprodukovatelnost v sérii je CV 1,47 – 1,76 %, mezi sériemi 2,30 – 3,06 %; výtěžnost: 100 – 104 %. Efekt nadbytku antigenu se do 30000 mU/l neprojevuje.
Elektrochemiluminiscence následuje po imunoreakci na sendvičovém principu, kdy se vzorek inkubuje
s biotinylovanou monoklonální protilátkou, specifickou vůči TSH a monoklonální protilátkou, specifickou vůči TSH značenou ruthéniovým komplexem a vzniká sendvičový imunokomplex. Přidají se mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem. Metoda je použitelná v rozsahu 0,005 – 100 mU/l (po ředění 10x do 1000 mU/l). Detekční limit je 0,005 mU/l (2 SD), funkční citlivost 0,014 mU/l (CV ≤ 20 %). Reprodukovatelnost v sérii CV 1,2 – 8,6 %, mezi sériemi 1,8 – 8,7 %.
Cytochemická analýza je nejcitlivější metodou pro stanovení TSH. Tak lze prokázat 50 nU/l TSH, což je 104x citlivější než běžné imunoanalýzy. Metoda ale vyžaduje zařízení pro tkáňovou kultivaci, kryostatické řezy, mikrodenzitometrické snímání a je velmi pracná, takže není vhodná pro rutinní použití. Tato technika je založena na detekci vzrůstu propustnosti lysozomové membrány buněk tyreoidálního folikulárního epitelu pro chromogenní substrát, která je vyvolána TSH. Segmenty tyroidní tkáně morčat jsou udržovány v kultivačním médiu neschopném proliferace a po určitou dobu vystavené působení testovaného materiálu; poté jsou ochlazeny na -70 °C v n-hexanu a řezány kryostatickým nožem. Jednotlivé řezy reagují s chromogenním substrátem, leucyl-β-naftylamidem, který proniká přes lysozomální membránu a reaguje s intralysozomální naftylamidázou. Markerem při této metodě je tedy leucyl-β-naftylamid. Barevný reakční produkt vzniká v každé folikulární buňce a měří se při 550 nm integrací snímaného mikrodenzitometrického signálu. Koncentrace TSH v testovaném materiálu je přímo úměrná absorbanci. Cytochemická analýza by mohla být pokládána
za referenční metodu, protože je nejcitlivějším postupem a měří biologickou aktivitu TSH. Nicméně vyžaduje specializovanou techniku a je dostupná pouze ve výzkumných centrech.
Řada firem nabízí kvalitativní průkaz TSH jako důkaz primárního hypothyreoidismu. Analýza je
na imunochromatografickém principu. Sérum se nakape do jamky v kazetě a přidá se protilátka vůči TSH, značená koloidním zlatem. Pak se vzorek nechá vzlínat přes plochu kazety, na které je nanesena kotvící protilátka vůči druhému epitopu TSH. Po 10 min se odečítá výsledek. Koncentrace > 5 mU/l se projeví jako růžový proužek.
National Institute for the Biological Standards and Control (NIBSC) poskytl jako WHO referenční materiál ampule (označené 81/565), obsahující 2 µg TSH z hypofýzy, což odpovídá 11,5 mU ± CV 0,38 %. Tento materiál byl schválen jako 3. mezinárodní standard pro TSH Expert Committee on Biological Standardization WHO
v listopadu 2003.
Data z USA 2001 uvádějí preciznost 4 – 8 % při koncentraci TSH 3 – 12 mU/l. Intraindividuální i interindividuální variace TSH jsou u zdravých dospělých během 7 dnů přibližně 20 %. Analytická preciznost vzhledem
k biologické variaci by měla být 10 %.
Toleranční limit EHK: 14 %.
Koncentrace TSH v séru je snížena: acylpyrin, anopyrin, dopamin, hemodialýza, ILGF-I, glukokortikoidy, hladovění, kouření, levedopa, pyridoxin, těhotenství, Thyreotom, aj.
Koncentrace TSH v séru je zvýšena: ALP, amiodaron, cvičení, EDTA, elektrošoky, heterofilní protilátky, jód, lidské protilátky vůči myším protilátkám, lithium, menopauza, menstruace, methimazol, monojódtyrosin, odvykání kouření, peritoneální dialýza, propylthiouracil, stres, valproát, aj.
