anti-EBV-EA; anti-HHV-4 (EA), antibodies against human herpes virus 4

EA = early antigen (časný)

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA). Stabilita v séru při 15 – 25 °C 4 – 24 h, při 4 – 8 °C 7 d, při -20 °C 3 – 12 měsíců.

ELISA metoda slouží pro kvantitativní/kvalitativní stanovení specifických IgG protilátek vůči časnému difuznímu (rozptýlenému) antigenu viru Epstein-Barrové (rekombinantní peptid EA-D). Jamky mikrotitračních destiček jsou potaženy rekombinantním peptidem EA-D. Po přidání vzorku nebo kalibrátoru se na EA-D naváží specifické IgG protilátky (inkubace 60 min, 37 °C). Po promytí fosfátovým pufrem (5x) se, díky IgG protilátkám vůči VCA p18 přítomným ve vyšetřovaném séru, konjugát (kozí protilátka vůči lidskému IgG spojená s křenovou peroxidázou) naváže na pevnou fázi (inkubace 60 min, 37 °C). Po promytí fosfátovým pufrem (5x) je enzymová aktivita po reakci s tetrametylbenzidinem a H₂O₂ (30 min, laboratorní teplota, ve tmě) úměrná koncentraci IgG protilátek vůči VCA p18 ve vzorcích nebo v kalibrátorech. Výsledná intenzita zbarvení jamek se měří po přidání stop činidla (0,8 M H₂SO₄) do 60 min fotometrem při 450/630 nm nebo 405/630 nm a na základě čtyřbodové kalibrace je úměrná množství protilátek ve vzorku. Rozsah měření 5 – 130 kU/l. Preciznost v sérii 3,4 – 6,3 %, mezi sériemi 3,0 – 17,0 %. Citlivost je 94,6 %, specifita 96,5 %. Lipemické (do 11,3 mmol/l triacylglycerolů), hemolytické (do 2,5 g/l hemoglobinu) a ikterické vzorky (do 513 µmol/l bilirubinu) neovlivňují výsledek testu.

ELISA IgG bez rozlišení EBV antigenu: protilátky specifické vůči EA, obsažené v testovaném vzorku, se vážou na antigen v reakčních jamkách mikrotitrační destičky (60 min, 37 °C). Po čtyřnásobném promytí se přidá konjugát fragmentu F(ab)´ králičí protilátky vůči lidskému IgG s navázanou křenovou peroxidázou, který se váže na tyto specifické protilátky (inkubace 60 min, 37 °C). Po čtyřnásobném promytí reaguje enzymová část konjugátu s chromogenem (tetrametylbenzidin) za vzniku modré zabarvení (30 min, 18 – 25 °C, tma).  Tato reakce je zastavena přidáním stop činidla, které způsobí žluté zbarvení. IgG proti buněčným antigenům jsou stejným způsobem detekovány v jamkách potažených kontrolním antigenem. Rozdíl v intenzitě barvy v jamce potažené specifickým antigenem a v jamce potažené kontrolním antigenem je měřítkem imunochemické reaktivity EBV-specifických IgG protilátek ve vzorku. Detekce se provádí při 450/615-690 nm do 60 min. Kvantitativní stanovení se vyhodnocuje v kU/l. Citlivost je 92 %, specifita 100 %. Preciznost v sérii 3,9 – 7,8 %, mezi sériemi 1,9 – 9,7 %. Lipemické, hemolytické a ikterické vzorky neovlivňují výsledek testu.

IFA je test určený k průkazu a semikvantitativnímu stanovení lidských IgG protilátek vůči časnému D (diffuse – rozptýlený) i R (restricted – lokalizovaný) antigenu (EA) EBV. Imunofluorescenční postup je dvojstupňová sendvičová imunoanalýza. V prvním kroku jsou séra ředěna fosfátovým pufrem. Ředěná séra jsou přidána do jamek destiček, kde jsou inkubována 30 min se substrátem (EBV). Po inkubaci se promytím fosfátovým pufrem odstraní volné protilátky ze séra. V druhém kroku jsou antigeny v jamkách převrstveny fluoresceinem (FITC) značenou kozí protilátkou vůči lidskému IgG. Při inkubaci (30 min) reagují imunokomplexy Ag-Ab s fluoresceinem značenou protilátkou vůči lidskému IgG. Po promytí a vysušení se jamky prohlížejí fluorescenčním mikroskopem (excitace 490 nm, emise 520 nm). Pozitivní reakce se objevuje v jamkách jako cytoplazmatická fluorescence barvy světle zeleného jablka proti pozadí červených EA negativních kontrolních jamek. Semikvantitativní hodnocení se provádí jako výsledný titr při postupném ředění pozitivních vzorků.

CLIA (nepřímá chemiluminiscenční analýza) je další dvojstupňový zábleskový postup, kdy se na magnetické částice potažené rekombinantním difuzním (rozptýleným) peptidem EA (D) naváží během první inkubace (10 min) protilátky vůči EBV-EA ze vzorku. Po promytí se na jejich další epitop připojí během druhé inkubace (10 min) monoklonální myší protilátka vůči lidskému IgG značená izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu přímo úměrná hladině IgG protilátek vůči EBNA-1. Rozsah měření je na základě dvoubodové rekalibrace vzorové křivky (zadané čárovým kódem) 5 – 150 kU/l (při vyšších hodnotách ředit diluentem 10x). Analytická citlivost je 5 kU/l. Preciznost v sérii 6,7 – 10,0 %, mezi sériemi 8,5 – 14,2 %. Linearita ředění je 87 – 119 %. Relativní senzitivita je 95,3 %, relativní specificita 99,6 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší.

WESTERNBLOT test umožňuje kvalitativní in-vitro stanovení lidských protilátek IgG vůči antigenům viru Epstein-Barrové. Test obsahuje proužky s elektroforeticky rozdělenými extrakty antigenů z EBV. Po 15 min inkubaci proužků v pufru (třepání) se v prvním reakčním kroku proužky blotu inkubují 30 min s ředěnými vzorky séra pacientů (třepání). V případě pozitivních vzorků, se specifické protilátky třídy IgG (také IgA a IgM) navážou na antigeny. Po trojnásobném promytí pufrem slouží k detekci navázaných protilátek druhá inkubace (30 min, třepání) provedená s kozí protilátkou proti lidským IgG značenou ALP (enzymový konjugát). Po trojnásobném promytí pufrem probíhá za třepání 10 min barevná reakce (substrát nitroblutetrazoliumchlorid/5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát). Reakce se zastaví trojnásobným promytím deionizovanou nebo destilovanou vodou. Po vysušení proužků lze takto semikvantitativně hodnotit vedle sebe IgG protilátky VCA, EA i EBNA.

Falešně negativní hodnoty: u dětí předškolního věku, u imunodeficitních pacientů.

Falešně pozitivní hodnoty: křížová aktivita jiných herpetických virů, polyklonální aktivace B lymfocytů u imunopatologických stavů (mononukleóza).