Alkaline phosphatase – bone isoenzyme, bAP

Chemické názvosloví připouští u enzymů pouze koncovku –asa, progresivní pravopis a řada současných lékařských publikací uvádí koncovku –áza. Mezinárodně uznávaná zkratka enzymu neexistuje, ale běžně se používá označení AP (Google 8 440 000), případně ALP (Google 537 000).

Odebírat nalačno minimálně 12 h hladovění. Odběr do séra se upřednostňuje před plazmou (antikoagulans heparin). Vyloučit hemolýzu. Stabilita vzorku: 15 - 25 °C: i 4 °C: 7 d (jinde: 20 – 25 °C 4 h, 4 – 8 °C 3 d), -20 °C: 1 rok (jinde 4 týdny). Při rozmrazování se aktivita ALP zvyšuje. Při analýze lyofilizovaných sér po rekonstituci vodou nutno vyčkat > 90 min, jinak jsou výsledky vyšší!

Elektroforéza je použitelná pro kvantitativní zastoupení kostního a jaterního izoenzymu v plazmě. Používá se membrána acetátu celulózy (škrob, agar, PAGE) v TRIS-barbitalovém pufru při pH 8,8. Elektroforéza probíhá při 4 °C a 250 V 60 min. Vyvolávání probíhá při 37 °C 60 min pomocí 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu  a p-toluidinové soli v 2-amino-2-metyl-1,3-propandiolovém pufru. Lze použít také 1-naftylfosfát + Fast Blue BB v pufru TRIS-borát-MgCl₂ nebo pufru uhličitan-hydrogenuhličitan). Fixace se provádí kyselinou octovou a měření denzitometrem. Metodu lze upravit přidáním lektinu (zpomaluje pohyb kostní ALP) a kostní izoenzym detekovat reflexním denzitometrem při 600 nm. Jinou variantou je přídavek neuramidinázy, která také zpomaluje nejvíce anodickou pohyblivost kostní ALP.

Postupná tepelná inaktivace umožňuje stanovit aktivitu jaterního a kostního izoenzymu. Vzorek se zahřívá na 57 °C 15 a 25 min. Ztráta aktivity by měla být po tuto dobu lineární a týkat se výhradně jaterního izoenzymu, takže kostní ALP se pak vypočte jako celková ALP mínus jaterní frakce.

Precipitace lektinem (aglutininem) získaným z pšeničných klíčků. Jestliže bylo elektroforézou zjištěno, že je ve vzorku biliární izoenzym, inkubací 30 min při 37 °C s Tritonem X-100 se zabrání jeho precipitaci. Následně se provede precipitace lektinem (37 °C 30 min) a roztok se odstředí. Supernatant se odstraní, sraženina se rozpustí ve fyziologickém roztoku a stanoví se aktivita kostního izoenzymu (jako celková ALP). Protože se vysráží zhruba 80 % kostního izoenzymu, je třeba naměřenou aktivitu ještě násobit 1,25.

Jiný postup doporučuje měřit aktivitu celkové ALP a aktivitu v supernatantu (metodou celkové ALP). S rozdílu aktivit (ALP x 1,118 – supernatant x 2,35) se pak vypočítá aktivita kostního izoenzymu. Při hodnotách aktivity > 16,6 µkat/l je nutné vzorek ředit. Preciznost mezi sériemi byla 3,0 – 3,5 %.

IRMA používá sendvičový postup, kdy je protilátka vázaná na stěně zkumavky, na ní se váže vzorek (1. inkubace) a po promytí konjugát protilátky s ¹²⁵I (2. inkubace). Po promytí se měří radioaktivita (1 min) gama-počítačem. Analytická citlivost metody je 2 µkat/l. Křížová reakce: jaterní izoenzym 2,5 – 5,8 %.

ELISA využívá specifického záchytu kostního izoenzymu v jamkách mikrotitračních destiček během inkubace s pufrem (3 h, laboratorní teplota). Po čtyřnásobném promytí se přidá substrát (4-nitrofenylfosfát) a inkubuje se 30 min za laboratorní teploty. Měření se provádí při 405 nm. Rozsah kalibrace na základě kvadratické kalibrační křivky je 2 – 140 µg/l. Analytická citlivost je 0,7 µg/l. Preciznost v sérii je 4 – 6 %, mezi sériemi 5 – 8 %. Křížová reaktivita: jaterní izoenzym 3 – 8 %, střevní izoenzym 0,4 %.

Poločas vymizení: kostní izoenzym přibližně 40 h.

Aktivitu snižuje: odběr do citronanu, ADTA, oxalátu, deficit vitaminu C; léky: azatioprin, cyklosporin (po počátečním přechodném zvýšení aktivity ALP), klofibrát aj.

Aktivitu zvyšuje: menopauza, po menopauze, hemodialýza, transplantace ledvin, věk (vrcholy: do 2 let, 6 – 8 let, 12 – 14 let), těhotenství (35 – 100 %); léky: anabolika, antibiotika, aminoglykosidy, amiodaron, anopyrin, antikonvulsiva, aspirin (při dlouhodobém užívání), Awelysin, erytromycin, esterifikované estrogeny samotné nebo v kombinaci s androgeny (mohou také aktivitu snižovat!), etanol, fenobarbital, fenotiaziny, chlorpromazin, interleukin-2, izoniazid, kolchicin, kontraceptiva, levotyroxin, lithium, orální kontraceptiva, metyldopa, morfium, rytmochin II, spasmoveralgin, verapamil aj. Všechny léky vyvolávající cholestázu způsobují zvýšení aktivity ALP, které může být až desetinásobné.