thyreoglobulin, Tg;

thyroglobulin, TG, hTG

Stanovení se provádí v séru. Stabilita při 15 – 25 °C 2 d, při 4 °C 3 – 7 d, při -20 °C 2 měsíce. Přítomnost protilátek vůči Tg vede zpravidla k falešně nízkým hodnotám Tg, a proto je nutné zároveň stanovovat anti-Tg protilátky.

RIA začíná pipetováním vzorku do zkumavek potažených myšími monoklonálními protilátkami vůči čtyřem různým epitopům Tg. Po inkubaci 3 h za laboratorní teploty se přidá pátá myší monoklonální protilátka vůči Tg značená ¹²⁵I. Zkumavky se nechají inkubovat za laboratorní teploty 16 – 20 h. Po promytí se vázaná aktivita ¹²⁵I se měří na gama-počítači 1 min. Koncentrace Tg v kalibrátorech a vzorcích je nepřímo úměrná změřené radioaktivitě. Kalibrační křivka se sestrojí na základě stanovení sérových kalibrátorů a hodnoty Tg přítomného ve vzorcích se odečtou z této křivky. Rozsah měření 0,2 – 500 µg/l. Analytická senzitivita 0,2 µg/l, funkční senzitivita 0,7 µg/l.

IRMA je dvoukrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním séra a diluentu do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči třem různým epitopům Tg. Roztoky se promíchají a inkubují 2 h při 18 – 25 °C za stálého třepání. Pak se roztok odsaje a zkumavky se promyjí. Přidá se čtvrtá myší monoklonální protilátka vůči Tg značená ¹²⁵I. Po inkubaci (24 h při 18 – 25 °C) se supernatant odsaje a zkumavky se 2x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,3 – 600 µg/l (při vyšších koncentracích se ředí nulovým kalibrátorem); analytická citlivost 0,3 µg/l.  Preciznost v sérii je ≤ 2,1 %, mezi sériemi ≤ 3,1 %. Linearita ředění je 100 – 128 %. Při koncentraci 100000 µg/l Tg jsou naměřené výsledky vyšší než 600 µg/l. Nepoužívejte hemolytické, ikterické ani lipemické vzorky. Přítomnost autoprotilátek proti tyreoglobulinu ve vzorku může interferovat se stanovením Tg. U stanovení využívajících protilátky existuje možnost interference heterofilních protilátek přítomných v pacientském vzorku.

ELISA používá dvou králičích protilátek vůči Tg: jedna je značená křenovou peroxidázou a druhá je zakotvená v jamkách mikrotitrační destičky. Do mikrotitrační destičky se pipetuje vzorek a inkubuje se 60 min; po promytí (3x) přidáme konjugát králičího IgG vůči lidskému Tg s peroxidázou a inkubujeme 30 min. Dále, po čtyřnásobném propláchnutí přidáme substrát tetrametylbenzidin a inkubujeme 10 min; přidáme stop činidlo (0,25 M H₂SO₄) a měří se při 450/620 nm do 10 min, kdy absorbance je přímo úměrná koncentraci Tg. Je-li absorbance příliš vysoká, lze použít filtr 405 nebo 415 nm. Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,6 – 400 µg/l (vyšší koncentrace se ředí diluentem 1+5). Mez detekce je 0,6 µg/l. Preciznost v sérii je 5 – 10 %, mezi sériemi 8 – 20 %. Silná hemolýza, lipémie a ikterus ruší analýzu. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Přítomnost autoprotilátek proti tyreoglobulinu ve vzorku může interferovat se stanovením Tg.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena myší monoklonální protilátka vůči Tg. V sendvičovém uspořádání se pipetuje Tg ze vzorku a myší monoklonální protilátka značená Eu³⁺. Po inkubaci (120 min, třepání) a promytí se přidá zesilovací roztok; reakční směs se třepe 5 min a celý postup probíhá za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci Tg ve vzorku a měří se do 1 h. Analytická citlivost je 1,7 µg/l. Rozsah metody na základě šestibodové kalibrace 1,7 – 1000 µg/l. Preciznost v sérii je 1,6 – 7,2 %, mezi sériemi 6,1 %.

CLIA je sendvičová chemiluminiscenční imunoanalýzy. K potažení pevné fáze (magnetické částice) jsou použity králičí polyklonální protilátky, v konjugátu jsou použity myší monoklonální protilátky vůči lidskému Tg značené izoluminolem. Během první inkubace (10 min) se Tg přítomný v kalibrátorech, vzorcích či kontrolách váže na polyklonální protilátku vázanou na pevné fázi a následně po promytí, při druhé inkubaci (10 min) konjugovaná monoklonální protilátka reaguje s Tg vázaným na pevnou fázi. Nenavázaný materiál se po inkubaci odstraní promývacím cyklem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk; intenzita signálu je nepřímo úměrná koncentraci Tg. Dvoubodová kalibrace je v tripletu pro rozsah měření Tg 0,2 – 1000 µg/l (vyšší koncentrace se ředí diluentem). Analytická citlivost je 0,2 µg/l, funkční citlivost 1,0 µg/l Tg. Efekt nadbytku antigenu nebyl prokázán do 137000 µg/l Tg. Preciznost v sérii je 1,2 – 7,0 %, mezi sériemi 3,9 – 11,4 %; linearita ředění 96,2 – 99,3 %, zpětný výtěžek 92 – 103 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 342 µmol/l neruší. Přítomnost autoprotilátek proti tyreoglobulinu ve vzorku může interferovat se stanovením Tg. U stanovení využívajících protilátky existuje možnost interference heterofilních protilátek přítomných v pacientském vzorku.

Jiné CLIA stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. Tg se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na biotinylovanou myší monoklonální protilátku vůči Tg imobilizovanou přes avidinový můstek na polystyrénové kuličce a na druhé vazebné místo Tg se naváže polyklonální ovčí protilátka vůči Tg konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 60 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná koncentraci PAPP-A ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 300 µg/l. Analytická citlivost je 0,2 µg/l, funkční citlivost 0,9 µg/l. Preciznost mezi sériemi 6,6 – 9,2 %. Při měření mohou interferovat heterofilní protilátky. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu neruší, zakalená séra se doporučuje upravit centrifugací. Při stanovení ruší EDTA.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující Tg, paramagnetické částice potažené streptavidinem, směs biotinylovaných myších monoklonálních protilátek vůči čtyřem epitopům Tg a monoklonální myší protilátka vůči Tg značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství Tg. Reagencie se musí skladovat při 2 – 10 °C. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,1 – 500 µg/l. (po ředění 5x nebo 10x promývacím pufrem až do 2500, resp. 5000 µg/l). Analytická citlivost 0,1 µg/l. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 40000 µg/l. Preciznost v sérii je 1,4 – 4,4 %, celková 2,2 – 6,6 %; linearita ředění 90,4 – 113,5 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (10 g/l), bilirubinu (171 µmol/l) a triacylglycerolů (20,3 mmol/l) neruší. Přítomnost autoprotilátek proti tyreoglobulinu ve vzorku může interferovat se stanovením Tg.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (35 µl) je inkubován s biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči Tg a monoklonální myší protilátkou vůči Tg značenou ruthéniovým komplexem. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině Tg ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,04 – 500 µg/l. Ředění při vyšších koncentracích 10x umožňuje stanovit 5000 µg/l Tg. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,04 µg/l, funkční citlivost 0,1 µg/l. Preciznost v sérii 1,2 – 5,5 %, mezi sériemi 2,6 – 5,9 %. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 120000 µg/l. Reagencie nutno skladovat při 2 – 8 °C. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu (6 g/l), bilirubinu (1128 µmol/l) a triacylglycerolů (22,8 mmol/l) a RF (< 600 kU/l) neruší. Křížová reaktivita TSH je 1,4 %. Ve vzácných případech je možné pozorovat interferenci způsobenou velmi vysokým titrem protilátek vůči streptavidinu nebo rutheniu. Přítomnost autoprotilátek proti tyreoglobulinu ve vzorku může interferovat se stanovením Tg. Výsledky Tg by proto měly být buď ověřeny Tg konfirmačním testem, který je založen na principu neutralizace specifických protilátek, nebo potvrzeny měřením autoprotilátek proti Tg.

LC-MS/MS: Vzorek je selektivně vysrážen síranem amonným. Precipitát je rozpuštěn v pufru hydrogenuhličitanu amonného při pH 8, redukován ditiotreitolem a alkylován jódacetamidem.

Jako vnitřní standard byl přidán ¹³C-značený peptid a vzorky byly rozkládány 16 h hovězím trypsinem. Protilátky na magnetických kuličkách byly přidány k zachycení sledovaných Tg peptidů, které byly pak eluovány LC a detekovány MS třemi fragmenty jak pro přirozený peptid, tak pro vnitřní standard. Metoda umožnila detekci v rozsahu 0,5 – 250 µg/l. Analytická i funkční senzitivita byla 0,5 µg/l. Preciznost v sérii byla 2,7 – 6,7 %, mezi sériemi 7,2 – 8,3 %.

Intraindividuální variabilita 4,4 – 14 %.

Mezinárodní standard z roku 1996: Human thyroglobulin reference material (CRM 457)

Toleranční limit EHK: 40 %.

Hodnoty snižuje: přítomnost imunologicky neaktivního Tg, pokles od narození do dospělosti, protilátky vůči Tg (kompetitivní test), vysoká koncentrace Tg (efekt nadbytku antigenu), tyroidektomie, těhotenství 3. trimestr; léky: hormony štítné žlázy, neomycin.

Hodnoty zvyšuje: těhotenství 1. - 2. trimestr, novorozenci, menstruační cyklus (maximum 23. den), protilátky vůči Tg (sendvičový test), krátce po biopsii štítné žlázy, nádory štítné žlázy, hypertyreóza, struma, tyroiditida, tyreotoxikóza.