kyselina L-askorbová, lakton L-3-ketothreohexuronové kyseliny; antiscorb;

systematický název: 2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lakton-2,3-enediol; (R)-3,4-dihydroxy-5-((S)- 1,2-dihydroxyethyl)furan-2(5H)-on

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans EDTA, oxalát nebo heparin). Před odběrem minimálně 1 den vyloučit příjem vitaminu C. Krev přechovávat při 4 °C a chránit před světlem (stabilita 1 měsíc); při 25 °C je krev stabilní 6 h. Sérum je stabilní při 25 °C ve tmě 6 h, při přidání trichloroctové kyseliny při 4 °C (bez TCA 4 h?) 1 měsíc, při -20 °C 2 měsíce, po přidání ditiotreitolu při -70 °C 6 let. Maximální hodnoty jsou časně ráno.

Fotometrie Ke vzorku se přidá roztok metafosforečné kyseliny. Pak se přidá 2,4-dinitrofenylhydrazin (spolu s tiomočovinou a CuSO₄) v H₂SO₄ 4,5 mol/l a inkubuje se 3 h při 37 °C. Pak se v ledové lázni přidává H₂SO₄ 12 mol/l. Měření se provede při 520 nm. Stabilita zbarvení alespoň 40 min. Kalibrace je lineární v rozsahu 0,56 – 113 µmol/l i když kalibrátory jsou do 227 µmol/l. Preciznost v sérii 1,7 %; zpětný výtěžek 96 – 104 %.

Jiná metoda používá kyseliny askorbové (acidifikační činidlo ve vzorku je kyselina metafosforečná) k oxidaci 2,6-dichlorfenol indofenolu v xylenu (přidává se ještě nasycený roztok kalafuny v petroleji) a měří se úbytek absorbance při redukci původního chromogenu při 520 nm. Jiná varianta používá navíc p-chlormerkuribenzoovou kyselinu, která potlačuje interference tiolů a nepoužívá xylen.

Enzymové stanovení je založeno na redukci 3-(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2,5-difenyltetrazolium bromidu vitaminem C na formazan při pH 3,5. Přitom se spotřebovává kyselina askorbová reakcí a askorbátoxidázou a kyslíkem. Reakce se měří při 578 nm. Enzymové stanovení se může provádět také na mikrotitračních destičkách a kromě fotometrické detekce (570 nm) také fluorimetricky (excitace 535 nm, emise 587 nm), ale nutno upravit ředění vzorku, protože stanovení je 10x – 100x.

Fluorimetrie sleduje reakci mezi kyselinou askorbovou a metylenovou modří. Fluorimetrie používá pro excitaci 664 nm a pro emisi 682 nm. Sleduje se pokles fluorescence, protože metylenová modř se redukuje na svou leuko-formu, která při 682 nm nefluoreskuje (má maximum 452 nm). Detekční limit metody je 0,74 µmol/l

Další fluorescenční metoda využívá pro reakci 4,5-dimetyl-o-fenylendiamin nebo o-fenylendiamin. Fluorimetrie používá pro excitaci 360 nm a pro emisi 440 nm (nebo 430 nm). Fluoreskující produkty se extrahují do izobutanolu (je specifičtější) nebo n-butanolu (stabilita fluorescence alespoň 24 h). Detekční limit metody je 0,034 µmol/l. Interference α-ketoglutarové, oxaloctové a pyrohroznové kyseliny jsou 1,4 – 12,7 %. Reakce probíhá 30 min v NH₃-NH₄Cl pufru při pH 9,4 a 25 °C. Rozsah měření je 0,3 – 227 µmol/l. Preciznost v sérii byla 1,2 %.

ELISA na mikrotitračních destičkách je kompetitivní postup, kdy se do jamek potažených myší monoklonální protilátkou vůči vitaminu C přidá vzorek nebo kalibrátor a konjugát vitaminu Cs křenovou peroxidázou. Po inkubaci (60 min, 37 °C) a promytí 5x se přidá tetrametylbenzidin s H₂O₂. Roztok se inkubuje 10 - 15 min při 37 °C ve tmě; pak se pipetuje stop činidlo (ředěná H₂SO₄). Absorbance při 450 nm se měří ihned a je nepřímo úměrná koncentraci vitaminu C ve vzorku. Na základě šestibodové kalibrace je rozsah metody 0,006 – 5,7 µmol/l. Preciznost v sérii je < 10 %, mezi sériemi < 10 %; linearita ředění 92 – 109 %, zpětný výtěžek 92 – 101 %. 

HPLC se provádí na reverzní fázi C18 na koloně 250x2,1 mm (velikost zrna 5 µm) v kombinovaném režimu izokratické a lineární gradientové eluce (0,01 % vodný roztok trifluoroctové kyseliny – 100 % metanol). Analýza trvá 35 min a umožňuje stanovit vitaminy C, B₁, B₂, B₅, B₆, B₉ a B₁₂ detektorem s diodovým polem (230 nm pro vitamin C). Doba analýzy je 35 min. Preciznost v sérii < 4 %, mezi sériemi < 7 %; zpětný výtěžek 93 – 100 %.

Jiný postup používá mobilní fázi vodu s octanem sodným a tetrabutylamoniumhydrogensulfátem, KCl a kyselinou octovou při pH 5 a 30 °C s průtokem 0,8 ml/min. Elektrochemický detektor je sestaven z uhlíkové elektrody a AgCl/KCl referenční elektrody. Ampérometrická detekce probíhá při konstantním potenciálu 0,6 V v rozsahu do 0,5 µA s dobou odezvy 8s. Detekční limit je 22,7 µmol/l. Rozsah měření do 2450 µmol/l.

LC-MS používá kolonu C30 2,1x150 mm (velikost zrna 3 µm). Mobilní fází je mravenčan amonný a acetonitril v gradientu s průtokem 0,6 ml/min při teplotě 15 °C. Jako vnitřní standard se používá pyridoxin-d₂. Hmotnostní detektor s elektrosprejí používá výhřev kapiláry 200 °C a napětí 4000 V. Vitamin C je extrémně nestabilní a rozkládá se ve směsi vitaminů již po 20 min i po okyselení a při teplotě 4 °C. Jeho retenční čas byl 1,2 min, m/z -175 a produkty m/z 87 (kolizní energie 21 V) a m/z 115 (kolizní energie 13 V).

Jiný postup používal kolonu s reverzní fází C18 250x4,6 mm (velikost zrna 5 µm). Mobilní fází byl metanol a vodný roztok heptafluoromáselné kyseliny s gradientovou elucí. Hmotnostní detektor byl vybavený kvadrupólem s ionizací elektrospreje a používalo se kontinuální přepínání mezi pozitivním a negativním modem. Napětí v kapiláře bylo 3200 V a sledovaly se ionty m/z 100 – 500 (pro kyselinu askorbovou m/z 175,4). Jako vnitřní standard byla použita kyselina hippurová. Kvasimolekulární ion Vitaminu C m/z 175 se sledoval v negativním modu s retenčním časem 3,6 min v koncentračním rozsahu 1,13 – 2839 µmol/l. Detekční limit byl 0,68 µmol/l. Preciznost v sérii byla 0,5 %, mezi sériemi 1,1 %; zpětný výtěžek 98,3 %.

Intraindividuální variabilita 25,8 %.

Hodnoty snižuje: pokles ve stáří (až poloviční hodnoty), kouření (pokles o 30 µmol/l), pasivní kouření (pokles až 20 µmol/l), stresové stavy, vliv světla, vysoké teploty, vliv kovů (Cu, Fe), kyslík, abusus alkoholu, anémie, menstruace, hemodialýza, hypertyreóza, infekční choroby, malabsorpce, obezita, horečnaté stavy, těhotenství; léky: aminopyrin, barbituráty, estrogeny, kyselina acetylsalicylová, nitrosaminy, paraldehyd, perorální kontraceptiva.

Hodnoty zvyšuje: tělesná zátěž, ovulace, vegetariánství.