folikulin, folikuly stimulující hormon; Follicle stimulating hormone

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparin) nebo moči (obvykle odpad za 24 h). Stabilita analytu v séru 1 d při 20 – 25 °C, 1 – 7 d při 4 – 8 °C, 1 – 60 měsíců při -20 °C. V moči 3 měsíce při -20 °C. Celá krev stálá alespoň 168 h. Při odběru do EDTA nebo do citronanu jsou hodnoty falešně nižší.

U fertilních žen závisí koncentrace na fázi menstruačního cyklu. Je vhodné uvést den cyklu.

K dispozici jsou stanovení, která umožňují simultánně vyšetřit FSH a LH (s markery ⁵⁷Co-LH + ¹²⁵I-FSH nebo Eu³⁺-LH + Tb³⁺-FSH).

Koncentrace FSH v séru se může změnit během 20 min až trojnásobně, proto se zejména v pediatrii dává přednost sběru moče za 3 h (výkyvy se vyrovnají) a 80násobnému zahuštění vzorku.

RIA v sekvenčním uspořádání, kdy v prvním kroku reaguje FSH ze vzorku se specifickou protilátkou a v následné inkubaci se pak přidá FSH značené ¹²⁵I, není již v komerční soupravě na trhu. I když se oba inkubační kroky podařilo výrazně zkrátit (30 + 60 min), je specifita reakce vzhledem k podobnosti gonadotropinů neuspokojivá. 

IRMA je jednokrokový sendvičový postup, který začíná pipetováním ředěného séra do zkumavek potažených myší monoklonální protilátkou vůči FSH a přidáním druhé protilátky vůči FSH značené ¹²⁵I. Po inkubaci (90 min, laboratorní teplota, třepání) se supernatant odsaje a zkumavky se 3x promyjí. Navázaná aktivita se změří gama-počítačem (1 min). Rozsah metody je 0,2 – 180 U/l; analytická citlivost 0,2 U/l, funkční citlivost 0,5 U/l. Preciznost v sérii je ≤ 2,6 %, mezi sériemi ≤ 6,3 %.

ELISA používá dvou protilátek: jedna je značená křenovou peroxidázou a druhá má biotinylovou kotvu. Mikrotitrační jamky jsou potaženy streptavidinem (v některých soupravách je monoklonální protilátka zakotvena přímo v jamkách). Po inkubaci 1 h a trojnásobném propláchnutí (protilátky se mohou přidávat i ve dvou krocích oddělených inkubací) se přidá substrát tetrametylbenzidin a inkubuje se 15 min ve tmě. Pak se přidá stop činidlo (0,15 M H₂SO₄) a měří se při 450 nm (obvykle do 30 min). Celý postup se realizuje za laboratorní teploty. Šestibodová kalibrace umožňuje měření v intervalu 0,6 – 100 U/l (některé soupravy do 200 U/l). Preciznost v sérii je 8,5 – 9,4 %, mezi sériemi 9,4 – 11,8 %. Zpětný výtěžek 91,7 – 106,7 %, linearita ředění 95,8 – 116 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 5000 (někde dokonce do 50000) U/l.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a poté latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči β-FSH. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu a nenavázaný materiál se oddělí promytím. Přidá se kozí polyklonální protilátka vůči α-FSH značená ALP v pufru TRIS. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Šestibodová kalibrace je v rozsahu 0,37 – 150 U/l. (Vzorky s hodnotami FSH > 150 U/l lze manuálně ředit 2x – hodnota po ředění musí být > 0,37 U/l). Preciznost v sérii je 3,6 – 7,7 %, celková preciznost metody je 5,1 – 10,2 %. Analytická senzitivita je 0,37 U/l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší. Křížová reaktivita TSH 1,2 %, ostatní ≤ 0,2 %.

Zesílená fluorescence rozložená v čase je označována jako TRACE (time resolved amplified cryptate emission), kdy se měří fluorescenční signál se zpožděním v homogenním prostředí. Donor (MAb-Eu³⁺v micele) po ozáření dusíkovým laserem 337 nm emituje světlo 620 nm s dlouhou životností (ms), akceptor (MAb-sběrný protein) generuje signál 665 nm s krátkou životností (ns). Jestliže jsou obě složky v imunokomplexu, pak dochází v imunokomplexu k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Měřený signál je přímo úměrný hladině FSH. Souprava už není na trhu.

DELFIA je heterogenní fluorescenční imunoanalýza, kde prodloužená fluorescence Eu³⁺ je zesílena speciálním roztokem, který uvolňuje Eu³⁺ do roztoku a současně tvoří jeho ochranný chelát. Na mikrotitračních destičkách je zakotvena protilátka vůči FSH. V sendvičovém uspořádání se pipetuje FSH ze vzorku a specifická protilátka značená Eu³⁺. Po inkubaci a promytí se přidá zesilovací roztok a třepe se 5 min za laboratorní teploty. Fluorescence (excitace 340 nm, emise 615 nm) je přímo úměrná koncentraci FSH ve vzorku a měří se do 1 h. Mez detekce metody je 0,05 U/l. Rozsah metody 0,2 – 250 U/l. Preciznost v sérii 5,9 – 8,6, mezi sériemi 9,2 – 16,0 %.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém uspořádání používá monoklonální myší protilátku vůči β-FSH zakotvenou na paramagnetických částicích, ke které se přidává ředěný standard nebo vzorek. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší monoklonální protilátka vůči α-FSH značená akridiniumkarboxamidem. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině FSH a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Metoda dovoluje měřit vzorky na základě šestibodové kalibrace v rozmezí hodnot 0,05 – 150 U/l (Vzorky s hodnotami FSH > 150 U/l lze automaticky nebo manuálně ředit; při automatickém ředění systém vzorek naředí 5x, po ředění musí být hodnota > 0,25 U/l). Preciznost v sérii je 2,6 – 4,2 %, celkově 3,2 – 4,6 %. Analytická senzitivita (2 SD nulového kalibrátoru) ≤ 0,05 U /l. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Podobný princip zábleskové luminiscence lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku pacientského séra se přidá polyklonální ovčí protilátka vůči FSH značená esterem akridinu. Po inkubaci 5 min při 37 °C se přidá a monoklonální myší protilátka vůči FSH kovalentně na paramagnetické částice ve fosfátovém pufru hovězího sérového albuminu. Po inkubaci 2,5 min při 37 °C následuje odsátí roztoku a promytí zkumavek. Pak se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk fotonásobičem při 429 nm na základě šestibodové kalibrace v rozmezí 0,3 – 200 U/l. Vzorky s hladinou FSH > 200 U/l se ředí 2x automaticky nebo manuálně jsou-li hodnoty > 400 U/l. Analytická citlivost je 0,3 U/l. Preciznost v sérii 2,0 – 2,9 %, mezi sériemi 0,3 – 2,7 %. Linearita ředění je 85 – 102 %, zpětný výtěžek 90,5 – 116,9 %. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus. Efekt nadbytku antigenu se při měření může projevit kolem 1000 U/l.

CLIA je další jednostupňový sendvičový zábleskový postup, kdy na magnetické částice potažené protilátkou se naváže FSH a současně se na jeho další epitop připojí druhá protilátka značená izoluminolem. Imunoreakce probíhá 10 minut, po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině FSH. Rozsah měření je na základě dvou kalibrátorů 0,25 – 400 U/l. Analytická citlivost je 0,25 U/l, funkční citlivost 0,75 U/l. Preciznost v sérii 2,3 – 3,8 %, mezi sériemi 2,9 – 4,8 %. Linearita ředění je 97 – 107 %, zpětný výtěžek 92 – 104 %. Efekt nadbytku antigenu se neprojevuje do 55000 U/l. V přítomnosti extrémně vysokých koncentrací hCG (přibližně 200 000 U/l) lze jsou hodnoty FSH přibližně o 35 % falešně nižší. Analýzu neruší hemolýza, chylozita nebo ikterus.

Jiné stanovení je založeno na sendvičové imunochemické reakci se sledováním luminiscence zesílené enzymem. FSH se v prostředí pufrovaného roztoku s obsahem sérových bílkovin váže na myší monoklonální protilátku vůči FSH imobilizovanou na polystyrénové kuličce a současně se na druhé vazebné místo FSH naváže monoklonální myší protilátka vůči FSH konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Reakce probíhá 30 min při 37 °C. Po odstranění nezreagovaného materiálu odstředěním a promytí se přidá substrát adamantyldioxetanfenylfosfát, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se rozpadá za vzniku záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita záření 425 – 500 nm je přímo úměrná hladině FSH ve vyšetřovaném vzorku. Výsledky jsou stanoveny podle kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace (v kvadrupletu) a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Rozsah kalibrace je do 170 U/l, avšak do hodnoty 50000 U/l nebyl pozorován efekt nadbytku antigenu. Analytická citlivost je 0,1 U/l. Preciznost v sérii 2,9 – 4,2 %, celková 4,1 – 7,9 %; zpětný výtěžek 101 – 138 %, linearita ředění 95 – 110 %. Neinterferují bilirubin, hemoglobin ani triacylglyceroly. Léčba neplodnosti pomocí FSH způsobuje tvorbu protilátek, které interferují při stanovení.

Další postup používá podobný luminogen Lumi-Phos 530. Do zkumavky se pipetuje standard nebo vzorek obsahující FSH a paramagnetické částice potažené kozí protilátkou vůči myšímu IgG s navázanou monoklonální myší protilátkou vůči FSH. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Přidá se druhá kozí protilátkou vůči FSH značená ALP. Po inkubaci se separací v magnetickém poli a promytím odstraní nenavázané složky. Dále se přidá chemiluminiscenční substrát. Emitované světlo je přímo úměrné množství FSH. Rozsah měření při 470 nm na základě šestibodové kalibrace je 0,2 – 200 U/l. (po ředění 2x až do 400 U/l). Preciznost v sérii je 3,1 – 4,3 %, mezi sériemi 4,3 – 5,6 %. Linearita ředění ±3,43 %. Ani vysoké koncentrace hemoglobinu, bilirubinu a triacylglycerolů neruší.

Chemiluminiscenční analýza v sendvičovém provedení, kdy FSH ze vzorku se váže na myší monoklonální protilátku vůči FSH zakotvenou v jamce. Po inkubaci (1 h, 37 °C, třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se myší monoklonální protilátka vůči FSH značená křenovou peroxidázou. Po inkubaci (1 h, 37 °C, třepání) se promytím (4x) odstraní volný materiál a přidá se luminogen (derivát luminolu + sůl peroxykyseliny) jehož oxidaci katalyzuje POD za vzniku světla. Činidlo pro přenos elektronů (substituovaný acetanilid) zvyšuje hladinu uvolněného světla a prodlužuje jeho emisi. Signál na základě šestibodové kalibrace je přímo úměrný koncentraci FSH ve vzorku a odečítá se mezi 5. a 15. min. Rozsah měření 0,2 – 200 U/l (vyšší koncentrace FSH jsou automaticky ředěné 20x). Analytická senzitivita 0,2 U/l, funkční senzitivita 0,66 U/l. Preciznost v sérii ≤ 3,1 %, mezi sériemi je ≤ 7,8 %; linearita ředění 86 – 114 %, zpětný výtěžek 90 – 119 %.

Homogenní chemiluminiscenční imunoanalýza v sendvičovém uspořádání je založena na technologii LOCI. Reagencie LOCI zahrnuji dvě syntetické reagencie na částicích a fragment monoklonální biotinylované protilátky vůči FSH. První reagencie (Chemibeads) je potažena monoklonální protilátkou vůči FSH a obsahuje chemiluminiscenční barvivo. Druhá reagencie (Sensibeads) je pokryta streptavidinem a obsahuje fotosenzibilizační barvivo. Vzorek se inkubuje s biotinylovanou protilátkou a reagencii Chemibeads a vytvoří se sendvičové komplexy částice-monoklonální protilátka-FSH-biotinylovaná protilátka. Poté jsou přidány reagencie Sensibeads, navážou se na biotin a vytvoří párové imunokomplexy s oběma částicemi. Ozářením komplexů světlem vlnové délky 680 nm se z reagencii Sensibeads uvolni singletový kyslík, který se rozptýlí do reagencii Chemibeads a spustí chemiluminiscenční reakci. Výsledný signál je měřen při vlnové délce 612 nm a je přímo úměrný hladině FSH ve vzorku. Analýza trvá 10 min při 37 °C. Rozsah metody je 0,2 – 200 U/l (ředění se nedoporučuje). Detekční limit je 0,2 U/l. Preciznost v sérii 1,4 – 1,9 %, mezi sériemi 2,2 – 2,7 %. Zpětný výtěžek 95 – 102 %, linearita ředění 89,2 – 108,7 %. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 40000 U/l. Hemolýza, chylozita ani ikterus neruší. RF 500 kU/l snižuje výsledek FSH o 13,5 %.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (40 µl) je inkubován s monoklonální myší protilátkou vůči FSH značenou ruthéniovým komplexem a biotinylovanou monoklonální myší protilátkou vůči FSH. Pak se přidají paramagnetické mikročástice potažené streptavidinem, na který se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Reakční směs se nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Výsledky jsou stanoveny na základě kalibrační křivky, která je pro přístroj specifická a je určena na základě dvoubodové kalibrace a vzorové křivky získané z čárového kódu činidla. Luminiscence je přímo úměrná hladině FSH ve vzorku. Metoda je použitelná v rozsahu 0,1 – 200 U/l. Ředění není nutné. Analytická citlivost (2 SD nulového kalibrátoru) je 0,1 U/l. Preciznost v sérii 1,4 – 2,0 %, mezi sériemi 2,9 – 5,3 %. Hemolýza, chylozita, ikterus a RF (< 2250 kU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Efekt nadbytku antigenu nebyl pozorován do 2000 U/l.

Referenční materiál nese označení WHO 2nd IS 94/632.

Toleranční limit EHK: 15 %.

Hodnoty snižuje: tělesné cvičení, obezita, pooperační stavy, estradiol, testosteron, slepota, před pubertou, práce s olovem, transplantace ledvin.

Hodnoty zvyšuje: chronický alkoholismus (až o 20 %), dioxin, ozařování, věk > 65 let, ovulace, menopauza, kouření, bolesti hlavy, puberta, hladovění.

V moči hodnoty zvyšuje hladovění a vegetariánství.

Všechny imunoanalýzy mají nespecifickou odezvu na přítomnost heterofilních protilátek.