Popis vyšetření: DEHYDRATÁZA KYSELINY 5-AMINOLEVULOVÉ

Zařezeno v kategoriích:

Synonyma:

hlavní název: porfobilinogen synthasa;

aminolevulát dehydratasa, δ-aminolevulát dehydratasa, dehydrasa δ-aminolevulové kyseliny, dehydratasa 5-levulové kyseliny, dehydratasa 5-aminolevulové kyseliny;

aminolevulinate dehydratase, δ-aminolevulinate dehydratase, δ-aminolevulinic acid dehydrase, δ-aminolevulinic acid dehydratase, aminolevulinic dehydratase, δ-aminolevulinic dehydratase, 5-levulinic acid dehydratase, 5-aminolevulinate hydro-lyase;

systematický název: 5-aminolevulát hydro-lyasa

Preanalytická fáze:

Stanovení se provádí v séru, plazmě (antikoagulans heparin nebo EDTA), někdy také v hemolyzátu erytrocytů. Vzorek nutno chránit před světlem. Zpracovat v den odběru nebo oddělit plazmu, erytrocyty promýt fyziologickým roztokem, a zamrazit na -20 °C. Stabilita vzorku při 4 °C 24 h, při -20 °C 1 měsíc.

Poznámky k analytické metodě:

Stanovení aktivity enzymu v hemolyzátu: Dehydratáza kyseliny 5-aminolevulové katalyzuje kondenzaci 2 molekul kyseliny 5-aminolevulové (ALA) na porfobilinogen (PBG). Jeho koncentrace se po inkubaci hemolyzátu s kyselinou 5-aminolevulovou stanoví spektrofotometricky Ehrlichovou reakcí s p-dimetylaminobenzaldehydem v prostředí 98 % CH3COOH, 70 % HClO4 a HgCl2. Hemolyzát se připraví inkubací krve 10 min v ledové lázni a s přídavkem destilované vody 10 min při 37 °C. Pak se přidá kyselina 5-aminolevulová a nechá se 60 min při 37 °C kondenzovat. Přidá se HgCl2 v CCl3COOH a směs se centrifuguje. K supernatantu se přidá Ehrlichovo činidlo a po 5 min se měří absorbance při 555 nm. Aktivita se počítá jako absorbance x 100 x 2 x 35 / hematokrit v % x 60 x 0,062; kde 100 je přepočet na %, 2 je faktor konverze PBG na ALA, 35 je diluční faktor, 60 je doba inkubace v min, 0,062 je extinkční koeficient. Aktivitu analyzovaného vzorku [U/l] lze také srovnat s aktivitou vzorků dárců a vyjádřit v %.  

Stanovení hmotnostní koncentrace ELISA: Jamky mikrotitrační destičky jsou potaženy protilátkou vůči dehydratáze ALA. Pak se přidá vzorek a biotinylovaná protilátka vůči dehydratáze ALA a také konjugát avidinu s křenovou peroxidázou. Po promytí se přidá tetrametylbenzidin a proběhne barevná reakce, která je zastavena zředěnou kyselinou sírovou. Měření se provádí při 450±10 nm. Celková doba analýzy je 4,5 h. Kalibrační křivka v rozsahu 0,313 – 20 µg/l je sestrojena na základě měření sedmi standardů. Detekční limit je 0,128 µg/l. Preciznost v sérii je < 10 %, mezi sériemi < 12 %; zpětný výtěžek 98 – 105 %, linearita ředění 81 – 105 %. Stanovení lze provádět v séru, lyzátu erytrocytů nebo jiném biologickém materiálu.

Významné interference:

Při otravě olovem je enzym inaktivován. Při použití antikoagulans oxalát/fluorid pokles 15 %, kuřáci pokles 13 %.