Measles antibodies, Morbilli

Odběr venózní srážlivá krev ráno nalačno. Krev se odebírá do 1 týdne od počátku choroby a následně za 2 – 3 týdny. K průkazu lze také použít likvor odebraný lumbální punkcí. Protilátky jsou v séru stabilní 2 d při laboratorní teplotě, 5 – 14 d při 4 – 8 °C a dlouhodobě při ‑20 °C.

Vyšetřují se jak IgG, tak IgM protilátky. Některé postupy (komplement fixační reakce, hemaglutinační inhibice) je ale nerozlišují.

Komplement fixační reakce V reakci je pět složek: antigen (HeLa buňky infikované virem), vyšetřované sérum pacienta, komplement, beraní krvinky, králičí sérum s protilátkami proti beraním krvinkám (tzv. amboceptor). Princip reakce lze popsat ve 4 krocích: smísí se zkoumané sérum, v němž byl inaktivován vlastní komplement a příslušný antigen (pozitivita: vzniknou komplexy antigen-protilátka, negativita: komplexy antigen-protilátka nevzniknou); přidá se morčecí komplement alexin (pozitivita: komplement se vyváže na komplexy antigen-protilátka, negativita: komplement se nevyváže a je nadále aktivní); mimo reakci se připraví tzv. hemolytický systém, tj. ovčí krvinky s navázanými protilátkami proti těmto (zdrojem protilátek je obvykle králičí antisérum proti ovčím krvinkám); do reakce se přidá hemolytický systém (pozitivita: komplement je vyvázán, tedy neaktivní a nedojde k hemolýze, negativita: komplement se vyváže na hemolytický systém tj. vlastně komplexy antigen-protilátka a dojde k hemolýze. Reakce se hodnotí v několika ředěních séra (1:2 až 1:256). Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze. Reakce je citlivá, ale nelze rozlišit jednotlivé třídy protilátek.

Hemaglutinační inhibice Principem reakce je inhibice hemaglutinačních účinků antigenu, tj. viru spalniček. Nutnou podmínkou jsou tedy hemaglutinační schopnosti antigenu. Při provedení reakce se nejprve vzorek séra (ředěného dvojkovou řadou) či plasmy smísí s antigenem viru spalniček a po inkubaci (15 min, 37 °C) se přidají taninované erytrocyty. Pokud je v séru dostatečná koncentrace specifických protilátek, tyto se naváží na antigen, a inhibují jeho hemaglutinační schopnosti. Většinou se reakce hodnotí pouze kvalitativně a provádí se v několika ředěních séra. Jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra dvojkovou řadou (tzv. titr) při kterém ještě nedošlo po 90 min k hemaglutinaci. Popsaná reakce je tzv. přímou reakcí inhibice hemaglutinace. Při testu se nerozlišují protilátky IgG a IgM.

RIA má pro toto stanovení již jen historický význam. Jako vázací antigen se používal purifikovaný ribonukleoprotein viru spalniček, na který se vázaly specifické protilátky. Dále se na protilátku vázal konjugát králičího IgG-¹²⁵I nebo IgM-¹²⁵I. Po promytí se měřila radioaktivita precipitátu gama-počítačem a byla přímo úměrná množství protilátek (IgG nebo IgM).

ELISA IgG umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgG vůči antigenům spalniček v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem spalničkového viru. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (také IgM) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgG značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgG protilátek proti antigenům spalničkových virů. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 3,2 – 9,4 %, mezi sériemi 1,5 – 5,0 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

Jako značku lze při ELISA použít také ALP (konjugovanou s kozí protilátkou vůči lidskému IgG) a substrátem je pak p-nitrofenylfosfát. Stop činidlo je 1,2 M NaOH. Absorbance p-nitrofenolu se odečítá při 405/620-690 nm a je přímo úměrná množství specifických protilátek. Při kvantitativním hodnocení se koncentrace protilátek vůči spalničkám ve vzorku uvádí na základě jednobodové kalibrace v dubletu v kU/l.

ELISA IgM umožňuje in vitro semikvantitativní nebo kvantitativní vyšetření na protilátky třídy IgM vůči antigenům spalniček v séru nebo plazmě. Reakční jamky mikrotitračních destiček jsou potažené antigenem spalničkového viru. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky sér inkubovány v jamkách 60 min při 37 °C. V případě pozitivního vzorku se specifické IgM protilátky (také IgG) váží k antigenům. Po promytí pufrem (3x) se k detekci navázaných protilátek provádí následně inkubace 30 min za laboratorní teploty s enzymovým konjugátem (protilátka vůči lidskému IgM značená peroxidázou), který je schopen vyvolat barevnou reakci, následně po promytí pufrem (3x), s přidaným tetrametylbenzidinem a H₂O₂. Po 15 min ve tmě se reakce zastaví 0,5 M H₂SO₄ a intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci IgM protilátek proti antigenům spalničkových virů. Měření se provádí při 450/620 nm do 30 min. Semikvantitativní výsledky jsou hodnoceny v poměru k absorbanci cutoff kalibrátoru tak, že výsledky < 0,9 jsou negativní; 0,9 až 1,1 jsou hraniční a > 1,1 jsou pozitivní. Přesnost v sérii 6,9 – 7,7 %, mezi sériemi 4,2 – 5,6 %. Senzitivita: > 95 %, specifita: > 95 %. Hemolytické, lipemické a ikterické vzorky nevykazují žádné interference do koncentrací 10 g Hb/l, 5,6 mmol/l TAG a 342 µmol/l bilirubinu.

Jako značku lze při ELISA použít také ALP (konjugovanou s kozí protilátkou vůči lidskému IgM) a substrátem je pak p-nitrofenylfosfát. Stop činidlo je 1,2 M NaOH. Absorbance p-nitrofenolu se odečítá při 405/620-690 nm a je přímo úměrná množství specifických protilátek. Při kvantitativním hodnocení se koncentrace protilátek vůči spalničkám ve vzorku uvádí na základě jednobodové kalibrace v dubletu v kU/l.

Nepřímá imunofluorescence IgG Do jamek destiček byla pipetována analyzovaná séra a přidáno sérum obsahující virus spalniček (kmen CDC) a neinfekční kultivační buňky. V každé jamce bylo 10 – 50 % infikovaných buněk. Po inkubaci 30min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s kozí protilátkou vůči lidskému IgG (těžkým řetězcům). Následovala další inkubace 30min při 20 – 25 °C ve tmě. Pak byly vzorky promyty (2x), překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky se hodnotí buď na 1 až 4 kříže, nebo se provádí ředění v dvojkové řadě a titr nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) byla hodnota ředění, při které došlo k fluorescenci hodnocené na 1+.

Nepřímá imunofluorescence IgM Vzorek musí být před analýzou zbavený od interferentů buď iontově-výměnnou chromatografií nebo imunoprecipitací IgG. Do jamek destiček byla pipetována analyzovaná séra a přidáno sérum obsahující virus spalniček (kmen CDC) a neinfekční kultivační buňky. V každé jamce bylo 10 – 50 % infikovaných buněk. Po inkubaci 30min při 20 – 25 °C vypláchnutí a promývání (2x) byl přidán konjugát fluorescein izotiokyanátu s kozí protilátkou vůči lidskému IgM (těžkým řetězcům). Následovala další inkubace 30min při 20 – 25 °C ve tmě. Pak byly vzorky promyty (2x), překryty glycerolovým médiem s fosfátovým pufrem a analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu. Vzorky se hodnotí buď na 1 až 4 kříže, nebo se provádí ředění v dvojkové řadě a titr nepřímé fluorescence (excitace 488 nm, emise 530 nm) byla hodnota ředění, při které došlo k fluorescenci hodnocené na 1+.

Revmatoidní faktor obsahuje autoprotilátky třídy IgM, které se přednostně váží na IgG imunokomplexy. Přítomnost těchto nespecifických IgM protilátek může způsobit falešně vyšší výsledky protilátek IgM vůči viru spalniček. Na druhé straně slabě vázaný patogen může být vytěsněný z vazby na IgM protilátku, protože vazba na IgG protilátku je silnější. To vede k falešně nižším výsledkům. Proto je třeba vzorek před vyšetřením na IgM protilátky zpracovat s absorbentem revmatoidního faktoru, který váže jak nespecifické IgM protilátky, tak protilátky vůči lidskému IgG.