Hepatitis B envelope Viral Antigen, Hepatitis B envelope Ag, Hepatitis Be Antigen, Hep Be Ag

Stanovení se provádí v séru nebo plazmě (antikoagulans: heparin, EDTA, citrát). Stabilita v séru při 4 °C 7 d.

Všechny soupravy jsou určeny pro kvalitativní stanovení.

ELISA Imunoenzymová souprava pro průkaz antigenu HBe v lidském séru a plazmě je založena na sendvičovém principu. Do jamek mikrotitračních destiček s navázanou monoklonální myší anti-HBe se pipetují standardy nebo vzorky. Inkubace 60 min při 37 °C. Po promytí 2x se přidá konjugát monoklonální myší anti-HBe s POD a inkubuje se 60 min při 37 °C. Po promytí 4x se přidá chromogen. Enzymová část konjugátu zbarví roztok tetrametylbenzidinu s H₂O₂ modře (18 – 25 °C, 30 min ve tmě). Tato reakce je zastavena přidáním zastavovacího roztoku (1 M H₂SO₄), který způsobí barevnou změnu na žlutou barvu. Na základě sendvičového principu testu je intenzita zbarvení (450/615-690 nm) přímo úměrná koncentraci HBeAg ve vzorku. Měření se provádí do 1 h. Absorbance průměru negativních + 0,05 je cut-off. Negativní výsledky < cutoff – 10 %, hraniční cutoff – 10 % až cutoff + 10 %, pozitivní > cutoff + 10 %. Preciznost v sérii je 3,8 – 6,4 %, mezi sériemi 8,7 – 11,4 %. Relativní senzitivita je 98,1 %, relativní specificita 99,4 %. Hemolytické vzorky mohou způsobit falešně vysokou reaktivitu. Vzorky pacientů po hemodialýze mohou vykazovat zvýšenou reaktivitu.

Imunoanalýza na mikročásticích (MEIA) v sekvenčním uspořádání probíhá tak, že se do reakční nádobky dávkuje vzorek ředěný TRIS pufrem a latexové mikročástice potažené myší monoklonální protilátkou vůči HBe. Po inkubaci se reakční směs přenese na fritu. Přidá se konjugát myších monoklonálních protilátek vůči HBe značený ALP v pufru TRIS, který obsadí jiný epitop HBeAg. Po inkubaci a promytí se dávkuje substrát 4-metylumbeliferylfosfát, který se štěpí na fluoreskující umbeliferon, jehož vznik se sleduje fluorimetricky. Fluorescence je přímo úměrná množství HBeAg. K jednobodové kalibraci (v dubletu) slouží indexový kalibrátor. Cut-off odpovídá průměrné reakční rychlosti kalibrátoru (nižší hodnoty než cut-off mají nereaktivní vzorky, naopak vyšší než cut-off mají reaktivní vzorky – mohou se případně ředit 200x). Preciznost v sérii je 3,5 – 4,9 %, mezi sériemi 3,6 – 6,5 %. Relativní senzitivita je 98,0 %, relativní specificita 99,1 %. Vzorky pacientů, kterým byly aplikovány myší protilátky, mohou vykazovat falešné hodnoty.

Chemiluminiscenční analýza v sekvenčním uspořádání začíná reakcí HBeAg ze vzorku s myší monoklonální protilátkou vůči HBeAg zakotvenou na paramagnetických částicích. Po inkubaci a promytí fosfátovým pufrem se přidá myší protilátka vůči HBeAg značená akridiniumkarboxamidem, která reaguje s dalším epitopem HBeAg. Po promytí fosfátovým pufrem se přidá 1,32 % peroxid vodíku a 0,35 M roztok hydroxidu sodného. Vzniklá chemiluminiscence je přímo úměrná hladině HBeAg a sleduje se fotonásobičem při 429 nm.Dvoubodová kalibrace (v tripletu) slouží k určení cutoff (0,9 x průměrná hodnota kalibrátoru 1 + průměrná hodnota kalibrátoru 2). Vzorky, které mají index cut-off  (signál vzorku / průměrný signál kalibrátoru) < 1,00 jsou nereaktivní na HBeAg, ≤ 1,00 jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 2,1 – 22,6 %, mezi sériemi 3,3 – 23 %. Relativní senzitivita je 99,5 %, relativní specificita 99,0 %. Silná hemolýza ruší. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

Podobný princip zábleskové luminiscence v sendvičovém uspořádání lze použít s esterem akridinu jako značkou. Ke vzorku se pipetuje, který se inkubuje 4 min při 37 °C, se přidají paramagnetické latexové částice potažené myší monoklonální protilátkou vůči HBeAg vázanou na částice přes biotin-streptavidinovou kotvu a nemagnetické latexové částice. Po inkubaci 17 min při 37 °C a promytí se přidá monoklonální myší protilátka vůči HBeAg značená esterem akridinu. Při další inkubaci (17 min při 37 °C) se připojí na odlišný epitop HBeAg. Po odsátí roztoku a promytí zkumavek se přidá peroxid vodíku a roztok NaOH a ihned se měří vznikající luminiscenční záblesk (intenzita signálu je přímo úměrná množství HBeAg) fotonásobičem při 429 nm. K určení cut-off se provádí dvoubodová kalibrace (v dubletu). Vzorky s koncentrací HBeAg < 0,8 indexu se považují za nereaktivní, 0,8 – 10 jsou neurčité a ≥ 10 indexu jsou reaktivní. Preciznost v sérii je 2,2 – 3,5 %, celkem 2,3 – 4,0 %. Relativní senzitivita je 98,2 %, relativní specificita 98,2 %. Koncentrace hemoglobinu 5 g/l, triacylglycerolů 33,9 mmol/l a bilirubinu 684 µmol/l interferují < 10 %. Heterofilní protilátky v lidském séru mohou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v reagenciích, čímž způsobuji interferenci při imunoanalýze.

CLIA je další sendvičový zábleskový postup, kdy HBeAg ze vzorku se během 20 min naváže na magnetické částice potažené monoklonální myší protilátkou vůči HBeAg značenou izoluminolem. Po promytí se přidá startér (0,12 % H₂O₂ + 4 % NaOH) a fotonásobičem se měří záblesk. Intenzita signálu je přímo úměrná hladině HBeAg. Dva kalibrátory upravují vzorovou kalibrační křivku. Výsledky lze vydávat v jednotkách kU/l PEI (Paul Ehrlich Institut). Vzorky, které mají hodnoty < 0,09 kU/l PEI jsou nereaktivní na HBeAg, 0,09 – 0,11 jsou nejasné a ≥ 0,11 jsou reaktivní ha HBeAg. Rozsah testu je 0,02 – 120 kU/l PEI. Preciznost v sérii 2,8 – 10,1 %, mezi sériemi 2,8 – 22,4 %; linearita ředění 74,9 – 105,7 %. Relativní senzitivita je 97,2 %, relativní specificita 98,8 %. Ani koncentrace hemoglobinu 10 g/l, triacylglycerolů 5,65 mmol/l a bilirubinu 85,5 µmol/l neruší.

Stanovení elektrochemiluminiscenční imunoanalýzou (ECLIA) v sendvičovém uspořádání trvá 18 min. Vzorek (35 µl) je inkubován s biotinylovanou myší monoklonální protilátkou vůči HBeAg a myší monoklonální protilátkou značenou ruthéniovým komplexem. V následné inkubaci pak paramagnetickými mikročásticemi potaženými streptavidinem, na které se naváže imunokomplex svou biotinylovou kotvou. Po inkubaci se reakční směs nasaje do měřící komůrky, kde se mikročástice zachytí magneticky na povrchu elektrody. Nenavázané látky se odstraní pomocí tripropylaminového činidla. Zavedení napětí na elektrodu vyvolá chemiluminiscenci, která se měří fotonásobičem při 620 nm. Cutoff je stanoveno na základě dvoubodové kalibrace. Luminiscence je přímo úměrná hladině HBeAg ve vzorku. Výsledky s indexem < 1,0 jsou nereaktivní na HBeAg, ≥ 1,0 jsou reaktivní na HBeAg. Preciznost v sérii 1,2 – 6,6 %, mezi sériemi 1,7 – 11,0 %. Detekční limit ≤ 0,3 kU/l PEI (Paul Ehrlich Institut). Relativní specificita je 100 %. Hemolýza (hemoglobin 16 g/l), chylozita (triacylglyceroly 17 mmol/l), ikterus (bilirubin 428 µmol/l) a RF (< 2400 kIU/l) neruší. Pacienti léčeni vysokými dávkami biotinu (tj. > 5 mg/den) by se neměli odebírat dříve než po 8 h od posledního podání biotinu. Vzácně mohou interferovat protilátky vůči streptavidinu nebo rutheniu.

Falešná negativita: mutanty HBV.